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重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析
2015-12-28
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重症肌无力患者骨骼肌肌肉蛋白成分分析
中华神经科杂志2000年第4期第33卷论著作者：任惠民周志刚陈向军黄俊吕传真单位：任惠民（200040复旦大学医学院神经病学研究所）；周志刚（200040复旦大学医学院神经病学研究所）；陈向军（200040复旦大学医学院神经病学研究所）；黄俊（200040复旦大学医学院神经病学研究所）；吕传真（医学神经生物学国家重点实验室）关键词：重症肌无力；肌，骨骼；蛋白质类【摘要】目的探讨重症肌无力（mg）肌肉中与收缩有关的肌球蛋白成分是否减少。方法用gubstraub溶液(myosin提取液)按常量（匀浆）和微量（浸出）方式提取10名正常人及17例mg患者肌肉的蛋白成分，用双盲法分别以常量及微量聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)方法分析肌肉蛋白成分,用双向电泳分析有差异的谱带。结果常量sds-page电泳图谱分析显示,相对分子质量约25000的蛋白谱带密度为4.14±1.33，mg患者肌肉为2.02±1.08，差异有非常显著意义（p＜0.001）；微量分析获得正常肌肉该蛋白谱带的密度为4.26±2.58，mg患者肌肉为1.34±0.79，差异亦有非常显著意义（p＜0.001）；双向电泳显示，有差异的25000蛋白略偏碱性，并至少由2个等电点相近的蛋白成分组成。用部分纯化的肌球蛋白鉴定显示，25000蛋白与肌球蛋白轻链无关。结论mg患者肌肉中25000蛋白水平明显低于正常人肌肉，提示该蛋白可能与mg发病或发展有关。analysisofproteincomponentsofskeletalmusclefromthepatientswithmyastheniagravisrenhuimin,zhouzhigang,chenxiangjun,etal.nstituteofneurology,medicalcenteroffudanuniversity,shanghai200040,china【abstract】objectivetoexplorewhetherthecomponentsofproteinassociatedwithmusclecontractionappeardecreasedinthemusclesofmyastheniagravis(mg).methodstheproteinswereextractedfrom10normalcasesand17casesofmgskeletalmuscleswithgubstraubsolution,andthecomponentsoftheproteinwereanalyzedbysds-pageincommonandmicromethodsindoubleblind.compositionofthedifferentialproteinbandwasobservedbytwo-dimensionalelectrophoresis.resultssds-pagepatternsshowedthatthedensityoftheproteinbandwithamassofabout25kdinmgmuscleswasmuchlowerthanthatinnormalmuscles.thevalueofdensityfor25kdproteinbandincommonanalysiswas4.14±1.33and2.02±1.08inthenormalandmgmuscles,respectively(p＜0.001),whileinmicroanalysisthedensityoftheproteinbandwas4.26±2.58innormaland1.34±0.79inmgmuscles,respectively(p＜0.001).thepatternoftwo-dimensionalelectrophoresisdemonstratedthatthedifferential25kdproteinbandwascomposedofmorethantwocomponentsappearingintheadjacentisoelectricpointonthealkalinesideofthegel,andtheywereprovedtobenotrelatedtothecomponentsofmyosinlightchains.conclusionitwassuggestedthatpathogenicallythedevelopmentofmgshouldbeassociatedwiththeinvolvementof25kdproteinoftheskeletalmuscles.【keywords】myastheniagravis；muscle,skeletal；proteins重症肌无力（mg）被认为是一种由乙酰胆碱受体（achr）抗体引起神经肌肉接头突触膜achr功能丧失的自身免疫疾病。但近年已发现，一系列的非achr骨骼肌抗体［1］、ryanodine受体抗体及补体c9等均与mg的发病有关［2］。最近，我们不仅从肌肉组织中筛选到5个在正常人和mg患者肌肉中表达有明显不同的新的基因片段［3］，而且发现在以pbs提取的mg患者肌肉蛋白成分中，1个相对分子质量约25000的蛋白的水平明显低于正常人肌肉。由于achr抗体阳性和阴性的mg患者临床表现相似，均为骨骼肌极易疲劳，并且已经知道duchenne和强直性等肌营养不良的肌病患者骨骼肌肌球蛋白轻链组成发生了改变［4］，那么，是否mg患者肌肉极易疲劳的唯一原因为achr功能的丧失，而不涉及肌肉蛋白，特别是与收缩有关的蛋白的变化呢？本研究就此问题进行探讨。资料和方法1．样品来源：正常人肌肉标本10份，取于10例骨折手术病人的肢体骨骼肌。mg患者肌肉标本17份，取于17例全身型mg患者，无呼吸肌受累，其中8例伴胸腺瘤，9例伴胸腺增生。肌肉取自mg患者胸腺切除手术切口周围的骨骼肌，标本均于-27℃保存。2．蛋白的提取及浓度的测定：蛋白按常量及微量两种方法进行提取。常量提取：肌肉样品取米粒大小置微量玻璃匀浆器，加入100μl肌球蛋白提取液gubstraub溶液(0.3mol/lkcl，0.10mol/lkh2po4，0.05mol/lk2hpo4,ph6.5)，冰浴下制成匀浆，吸出肌肉匀浆，加50μl提取液洗涤，合并匀浆液并放置4℃过夜，10000×g离心15min，上清液再经25000×g离心10min，按spector［5］方法测定蛋白浓度。微量提取：将低温贮存的肌肉标本移至4℃冰箱，放置片刻使其软化，取一小块肌肉置解剖镜下滴加含20％甘油的生理盐水，剥取肌纤维10根左右，放置0.5mlep管底部，加入10μlgubstraub溶液，4℃过夜，离心后吸取上清液，蛋白定量后冷冻保存。3．肌球蛋白的部分纯化：基本按konagaya等［6］方法进行。简言之，取正常人与mg患者肌肉各1块（约10mm3），按上述常量提取法获得蛋白上清液，该上清液以14倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10000×g离心10min，沉淀用100μlgubstraub溶液溶解，再以9倍体积的预冷无离子水稀释，混匀后10000×g离心10min，沉淀用50μlgubstraub溶液溶解。4．蛋白的单相电泳分析：基本按laemmli［7］方法进行非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）分析。制胶及电泳缓冲液均为含0.1％sds的tris/gly,ph8.3。常量电泳分析蛋白加样量均为30μg,凝胶用考马斯亮蓝染色。微量电泳分析加样量均为1μg,蛋白检测基本按kirkeby等［8］方法进行银染。5．蛋白双向电泳分析：基本按任惠民等［9］方法进行。第1向等电聚焦的胶长约40mm，直径0.7mm，凝胶浓度为5％（含4％ph3.5～10.0的ampholyte,5%甘油和1％尿素）。蛋白加样量为30μg，凝胶上蛋白用银染显色。6．蛋白分析及统计方法：将所需比较的蛋白谱带经生物电泳图像分析仪扫描并计算密度。检测结果以±s表示，两组间比较采用t检验。结果1．肌肉蛋白的微量和常量分析电泳图谱：图1左侧为常量提取的肌肉蛋白电泳图谱，图1右侧为微量提取的肌纤维蛋白经电泳分离的银染图谱。2种方法分析的结果均显示，相对分子质量约25000蛋白谱带浓度在正常肌肉中明显高于mg肌肉。左：常量蛋白电泳分析；右：微量蛋白电泳分析2、7、8：正常肌肉;1、3、4、5、6、9、10：mg肌肉图1正常及mg肌肉蛋白的sds-page分析2．正常人肌肉与mg患者肌肉25000蛋白水平的比较：常量电泳分析，25000蛋白谱带经扫描计算，密度在正常肌肉中为4.14±1.33，mg肌肉中为2.02±1.08,差异有非常显著意义(p＜0.001)。微量电泳分析，25000蛋白谱带密度在正常肌肉中为4.26±2.58,mg肌肉中为1.32±0.79,差异亦有非常显著意义(p＜0.001)。3．蛋白的双向电泳图谱：图2a为正常人及mg患者肌肉蛋白的双向电泳图谱。从图2a可看出单相sds-page图谱所显示的25000谱带至少由2个蛋白成分组成，正常肌肉与mg肌肉中有明显差异的是1个偏碱的蛋白成分。图2b为提取的肌肉蛋白与部分纯化的肌球蛋白提取物双向电泳图谱。可以看出，有差异的25000蛋白与肌球蛋白提取物获得的蛋白成分无关。讨论人们很早就对mg患者肌肉的形态学特征及与肌肉收缩有关的重要化学物质，如肌球蛋白、肌动蛋白等进行了研究。虽然发现mg患者血清中抗肌球蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白等抗体滴度高于健康人［10］,但迄今仍没有充分的证据说明mg患者肌细胞中调控肌纤维收缩的粗丝、细丝和z带等形态学特征以及与肌肉收缩有关的蛋白合成发生了明显的改变，即使是在mg患者胸腺组织，也未发现肌样细胞(myoidcells)的数目和结构以及对肌球蛋白、肌钙蛋白等抗体的染色反应与正常人有明显的差别［11］。因此，目前对mg的研究主要集中在对achr的结构、抗体与抗原免疫学特征、应答achr功能丧失的免疫学机制等方面。那么，mg患者肌细胞内的化学物质，特别是dna与蛋白是否真的没有发生改变呢？答案是否定的。a.正常人及mg患者肌肉蛋白的双向电泳图谱左：正常人肌肉；右：mg患者肌肉；中：标准相对分子质量蛋白ac:肌动蛋白；tp:肌钙蛋白；mlc：肌球蛋白轻链；ief：等电聚焦；sds-page：聚丙烯酰胺凝胶电泳b.部分纯化肌肉收缩蛋白与正常肌肉蛋白双向电泳图谱左：正常人部分纯化肌肉收缩蛋白；右:正常肌肉蛋白图2gubstraub溶液提取的肌肉蛋白双向电泳近年来，我们从肌肉中已经筛选到5个新的基因片段，并证实其中有3个基因在正常人与mg患者肌肉中的表达有明显的差异［3］。最近我们用sds-page分析了pbs提取的正常人骨骼肌及mg患者骨骼肌的蛋白成分，发现正常人肌肉中有一个相对分子质量约25000的蛋白的水平明显高于mg患者肌肉。在本研究中，我们改用肌球蛋白提取液gubstraub溶液提取正常与mg患者肌肉的蛋白成分，亦发现mg患者肌肉中相对分子质量约25000蛋白谱带水平明显低于正常肌肉，经扫描计算，该谱带密度在正常人肌肉与mg患者肌肉中的差异有非常显著意义（p＜0.001）。双向电泳显示，该谱带是由数个等电点十分接近的蛋白成分构成（图2a），并且它们不是肌球蛋白的轻链成分（图2b）。在过去的研究中，我们曾对正常及交叉神经支配的大鼠快、慢肌单纤维的肌球蛋白轻链特征进行过探讨。发现在正常大鼠中，快肌和慢肌的收缩速度和肌球蛋白轻链的数目是由快、慢肌本身决定的，与肌纤维的atp酶染色分型无关［12］。在交叉神经支配后，即快肌用慢肌神经支配，慢肌用快肌神经支配后，原先为快肌的肌球蛋白轻链类型随时程逐渐转变为慢肌的轻链类型；反之，原先为慢肌的轻链类型则转变为快肌的轻链类型［13］。因此，我们认为神经支配对肌肉的收缩起着十分关键的作用。然而，对mg患者肌肉而言，它们仍受神经的支配，为何其收缩功能却发生了明显的改变呢？用achr功能的丧失解释mg患者肌肉衰弱与易疲劳的原因似乎很有道理，但是为何mg患者经血浆置换、药物治疗甚至休息后，肌肉的收缩状况会得以改善？即使改善是短暂的。此外，为何achr抗体阴性患者临床表现亦与achr抗体阳性患者相同。我们认为，mg患者肌肉的收缩功能发生障碍的原因除achr功能丧失外，势必还有其他原因，很可能与mg肌肉内的某些物质缺乏，或者合成与消耗的失衡有很大关系。尽管目前我们尚未能确定用gaubstraub溶液提取的肌肉蛋白和用pbs提取的肌肉蛋白成分中所发现mg缺少的25000蛋白是否为同一物质，但由于它们在mg患者肌肉中明显缺少，就有必要阐明该蛋白缺少的原因以及它与mg发病和发展的关系，并对该蛋白的结构与功能进行深入的研究。需要指出的是，为了更客观地反映出正常与mg肌肉蛋白成分是否存在差异，在本研究中，我们采用了双盲法进行电泳分析和谱带密度扫描。在进行常量分析的同时，也采用了超微量分析，以保证本研究结果的客观性、可比性。然而，mg患者肌肉中25000蛋白的减少是否具有特异性，以及它在肌无力发病机制中的意义有待进一步研究。参考文献1，hofstadh,gilhusne,matrer,etal.non-receptormuscleantibodiesinmyastheniagravisareofig1andig4subclasses.autoimmunity,1992，12:271-276.2，skeiego,pandeyjp,aarlija,etal.autoimmunitytoryanodinereceptorandtitininmyastheniagravisisassociatedwithgmallotypes.autoimmunity,1997,26:111-116.3，周志刚，武勇琴，任惠民,等.重症肌无力差异片段p10在人肌肉和胸腺中的表达.中华神经科杂志,2000,33:20-23.4，giomettics,danonmj,andersonng.humanmuscleprotein:analysisbytwo-dimensionalelectrophoresis.neurology,1983,33:1152-1156.5，spectort.refinementofcoomassiebluemethodofproteinquantitation:asimpleandlinearspectrophotometricassayforlessthanorequalto0.5to50microgramofprotein.analbiochem,1978,86:142-146.6，konagayam,konagayak,horikawah,etal.increasedserummyosinlightchain3levelinneuromusculardiseases.musclenerve,1987,10:415-421.7，laemmliuk.cleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyofbacteriphoget4.nature,1970,227:680-685.8，kirkebys,moed,bog-hansentc.thesilverstainingprocedureofsodiumdodeclysulfategelmaybeacceleratedbyshorteningfixationtime.electrophoresis,1993,14:51-55.9，任惠民，萧云，周兆年.离体灌流大鼠左右心肌应激蛋白增加的非一致性.中国应用生理学杂志,1997,13：143-147.10，takayam,kawaharas,nambat,etal.antibodiesagainstmyofibrillarproteinsinmyastheniagravispatients.tojaijexpclinmed,1992,17:35-39.11，vincenta,whitingpj,heidenreichf,etal.monoclonalantiacetylcholinereceptorantibodiesasprobesforhumanacetylcholinereceptorinmyastheniagravis.jreceptres,1988,8:143-159.12，任惠民，陈秀芳，章生艮.大鼠快慢肌单肌纤维肌球蛋白轻链的分析比较.动物学研究，1984,5：359-367.13，renhm,zhangsg.changesofmyosinlightchainpatternsinmusclefibersaftercross-reinnervation.kexuetongbao,1990,35:1570-1572.(收稿日期：1999-10-22)（责任编辑：jbwq）
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