赵和平,解燕茹,山西医科大学第一医院综合科山西省太原市030001作者贡献分布:此课题由赵和平与解燕茹设计;研究过程由解燕茹操作完成;本论文写作、数据分析由解燕茹与赵和平完成.通讯作者:赵和平,教授,030001,山西省太原市,山西医科大学第一医院综合科.zhpyx168@126.com电话:0351-4639468收稿日期:2009-05-11修回日期:2009-07-28接受日期:2009-08-03在线出版日期:2009-08-18ExpressionofBcl-2andBaxinhepatocytesinnonalcoholicfattyliverdiseaseHe-PingZhao,Yan-RuXieHe-PingZhao,Yan-RuXie,GeneralDepartment,theFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ShanxiProvince,ChinaCorrespondenceto:ProfessorHe-PingZhao,GeneralDepartment,theFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,ShanxiProvince,China.zhpyx168@126.comReceived:2009-05-11Revised:2009-07-28Accepted:2009-08-03Publishedonline:2009-08-18AbstractAIM:Toinvestigatetheroleofapoptosis-regulatedproteinsBcl-2andBaxintheprogressionofnonalcoholicfattyliverdisease（NAFLD）inrats.METHODS:AnexperimentalratmodelofNAFLDwasestablishedbyfeedingratsafat-richdiet（NAFLDgroup）.Controlanimalswerefedastandarddiet（controlgroup）.Hepaticsteatosis,inflammationandfibrosisweregradedbyroutineHEstainingofliversections.TheexpressionlevelsofBcl-2andBaxproteinsintheliverweredeterminedbyWesternblot.RESULTS:TheNAFLDmodelratsexhibitedmildsteatosisatweek4,simplefattyliveratweek8,andseveresteatohepatitiswithfibrosisatweek12.WesternblotanalysisshowedthathepaticexpressionofBaxproteinintheNAFLDgroupwasmorepronouncedfromweek4,andcontinuedtoriseatweeks8and12whencomparedwiththecontrolgroup（0.61±0.03,0.78±0.03and1.02±0.03vs0.51±0.03,respectively;allP<0.01）,whiletheexpressionofBcl-2decreasedwiththeprogressionoffattyliver（0.39±0.01,0.28±0.01and0.15±0.01vs0.52±0.01,respectively;allP<0.01）.Bcl-2/BaxratiointheNAFLDgroupdecreasedinatime-dependentmanner,particularlyprominentatweek12.CONCLUSION:NAFLDmaycauseincreasedhepaticexpressionofBaxbutdecreasedexpressionofBcl-2,andthedecreaseinBcl-2/Baxratiomayacceleratehepatocyteapoptosis.KeyWords:Nonalcoholicfattyliverdisease;Apoptosis;Bcl-2;BaxZhaoHP,XieYR.ExpressionofBcl-2andBaxinhepatocytesinnonalcoholicfattyliverdisease.ShijieHuarenXiaohuaZazhi2009;17（23）:2409-2412摘要目的:探讨凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax表达在大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的作用. 方法:采用高脂饮食建立大鼠NAFLD模型,以正常饮食设立对照组.HE染色观察肝脏脂肪变、炎症活动和纤维化程度,采用Westernblot检测Bcl-2、Bax在肝脏组织中的表达. 结果:实验组大鼠4wk可见轻度脂肪变,8wk呈单纯性脂肪肝改变,至12wk肝小叶内肝细胞弥漫性脂肪变,伴大量炎性细胞浸润,个别出现肝纤维化.Westernblot结果显示,实验组大鼠4、8、12wk肝组织Bax蛋白表达显著高于对照组（0.61±0.03,0.78±0.03,1.02±0.03vs0.51±0.03,均P<0.01）,Bcl-2蛋白随着造模时间的延长,表达逐渐下降（0.39±0.01,0.28±0.01,0.15±0.01vs0.52±0.01,均P<0.01）,Bcl-2、Bax两者比率逐渐降低,尤以12wk降低
明显.结论:在NAFLD发生过程中,细胞凋亡调节蛋白Bax表达上调,Bcl-2表达减少,二者表达的相对比例发生异常.这可能是NAFLD中肝细胞发生凋亡的重要原因之一.关键词:非酒精性脂肪性肝病;细胞凋亡;Bcl-2;Bax赵和平,解燕茹.Bcl-2、Bax蛋白表达在非酒精性脂肪性肝病中的作用. 世界华人消化杂志2009;17（23）:2409-2412http://www.wjgnet.com/1009-3079/17/2409.asp0引言目前在非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）的发病机制中,Dayetal[1]提出的“二次打击”学说得到普遍公认.然而近年来随着对凋亡的研究,不断有证据表明在NAFLD中,肝细胞凋亡可能是单纯非酒精性脂肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎“二次打击”理论的关键步骤,也是该过程的重要标志[2],与炎症程度和纤维化进展相关.细胞凋亡受多种凋亡基因调控,其中Bcl-2家族成员在细胞凋亡的基因调控过程中起着至关重要的作用[3],尤其这一家族的两个代表性成员Bcl-2和Bax,分别是凋亡抑制和促进因子,两者的比率Bcl-2/Bax是调控细胞死亡的“可变电阻器”[4].本研究以高脂饮食构建非酒精性脂肪肝大鼠模型,以探讨Bcl-2、Bax蛋白表达与NAFLD进展的关系.1材料和方法1.1材料健康♂清洁级Wistar大鼠40只,体质量180-220g,购自河北医科大学.鼠抗人Bcl-2、Bax、β-actinmAb以及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠多克隆抗体购于SantaCruz公司.1.2方法1.2.1造模与采集标本:正常喂养1wk后,按体质量层次随机分为正常对照组（10只）、实验组（30只）.正常组以普通饲料喂养,实验组以85%普通饲料+13%猪油+2%胆固醇[5]喂养,胆固醇购自成都科龙化工试剂厂.实验动物自由进食和饮水,于实验第4、8、12周末分别处死10只模型组大鼠,正常组在实验第12周末处死,留取血清和肝组织标本.部分肝组织经40g/L甲醛固定,备做病理切片,其余肝组织-70℃冰箱冻存,以备蛋白提取.1.2.2血清标本的检测和肝组织病理观察:将采集的全血用低温离心机迅速分离血清,以全自动生化分析仪（OlympusAu1000）测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）.光镜下观察肝组织学变化,参照《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[6]及2001年《病毒性肝炎防治方案》[7],肝脂肪变分为4度（F0-4）,炎症活动度分为3级（G0-3）,肝纤维化分为4期（S0-4）.1.2.3检测Bcl-2、Bax蛋白表达和激活水平:从深低温冰箱中取出冻存的肝组织经RIPA液裂解后,15 000g离心10min,弃沉淀,收集上清液用Bradford法测定总蛋白含量.加样蛋白含量100μg经10%SDS-PAGE电泳分离,4℃条件下经3-4h将蛋白电转移至硝酸纤维素膜,置膜于含50g/L脱脂奶粉中（TBST缓冲液稀释）封闭1h,分别加入特异性鼠抗人Bcl-2、BaxmAb（1∶500稀释）、鼠抗人β-actinmAb以及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠多克隆抗体（1∶5000稀释）进行免疫反应,以增强化学发光显色系统显色,超敏胶片曝光,以β-actin为内参照.统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析,计量资料用mean±SD表示,采用方差分析和LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1大鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平和肝组织学病理正常组大鼠血清ALT、AST、TC、TG均无异常,肝组织学表现为肝小叶结构完整,肝细胞呈多边形围绕中央静脉呈放射状分布,大小一致.与正常对照组相比,模型组大鼠第4周起血清转氨酶（ALT、AST）血脂（TC、TG）开始增加（P<0.05）,肝组织显示散在肝细胞轻度脂肪变,个别细胞内可见大泡性脂肪滴,但肝小叶形态完整,汇管区界限清楚,无明显炎性细胞浸润,无纤维化（F0,G0-1,S0）;随着造模时间的延长,至实验第8、12周大鼠血清中转氨酶、血脂含量较正常对照组明显升高（P<0.05或0.01,表1）.实验组8wk大鼠肝组织病理均呈现单纯性脂肪肝,肝脂肪变以大泡性为主,肝腺泡3区病变最重,肝小叶结构紊乱（F2,G2,S1）;至12wk大鼠肝脏均见肝小叶内肝细胞弥漫性脂肪变,大泡性与小泡性均存在,大部分肝细胞肿胀,胞质疏松呈气球样改变,同时小叶内见局灶性肝细胞坏死,有明显淋巴细胞浸润,伴纤维化（F3-4,G3,S2）（图1）.
图1 各组大鼠肝脏组织病理学改变（HE×300）.A:正常对照组;B:实验组8wk;C:实验组12wk.
表1 各组大鼠血清标本转氨酶、血脂变化（mean±SD）
2.2Bcl-2、Bax蛋白表达正常对照组大鼠肝组织均表达一定量的Bcl-2（0.52±0.01）、Bax（0.51±0.03）蛋白,且二者比值（1.03±0.06）保持平衡,随着造模时间的延长,实验组大鼠Bcl-2蛋白表达量较正常组逐渐减少（分别为0.39±0.01,0.28±0.01,0.15±0.01,P<0.01）,Bax蛋白表达逐渐增多（分别为0.61±0.03,0.78±0.03,1.02±0.03,P<0.01）,Bcl-2/Bax逐渐下降分别为（0.64±0.03,0.36±0.02,0.14±0.01）,尤以12wk降低明显（P<0.01,图2）.
图2 各组大鼠肝组织Bcl-2、Bax蛋白表达.1:正常组;2:模型组4wk;3:模型组8wk;4:模型组12wk;bP<0.01vs正常组.
