实时定量RT-PCR检测急性白血病患者中WT1表达点击：作者：来源：日期：2007-03-07本站论坛顾伟英 陈子兴 曹祥山 胡绍燕 朱江 王志林 严峰 王玮 岑建农 沈慧玲 钱军<BR>[摘要] 目的 探讨急性白血病患者骨髓中WT1的表达水平。 方法 建立实时定量RT-PCR方法，采用LightCyclerPCR仪检测了108例急性白血病患者和23例非白血病患者骨髓中WT1及内参GAPDH的表达水平，以WT1<SUB>N</SUB>=（WT1拷贝数/GAPDH拷贝数）×10<SUP>4</SUP>计算WT1表达水平。结果 初诊与复发AL患者骨髓中WT1N的中位表达水平分别为75.10和89.56，明显高于CR组和对照组（分别为2.07和1.51），对照组与CR组之间及初诊与复发组之间无统计学差异；70例初诊急性白血病中ALL、M<SUB>1</SUB>、M<SUB>2</SUB>、M<SUB>3</SUB>亚型WT1N表达水平明显高于M<SUB>5</SUB>，即粒系表达明显高于单核系，且WT1表达水平与外周血WBC计数、骨髓原始细胞比例、MDR<SUB>1</SUB>无相关性，但与染色体核型有关。对其中2例患者动态检测WT1可提示白血病复发。结论 WT1在急性白血病患者骨髓中高表达，可作为白血病疗效考核及监测残留病灶的指标。<BR>[关键词] 白血病，急性；基因，WT1；逆转录聚合酶链反应<BR>DetectionofWT1expressioninbonemarrowofacuteleukemiawithreal-timequantitativeRT-PCR GUWeiying,CHENZixing,CAOXiangshan,HUShaoyan.TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,JiangsuInstituteofHematology,Suzhou 215006,China<BR>[Abstract] Objective Toinvestigatewilms’tumorgene（WT1） expressionlevelsinbonemarrow（BM）ofacuteleukemiapatients（Als）.Methods Real-timequantitativeretroversepolymerasechainreaction（RQ-RT-PCR）methodwasestablishedfordetectingWT1andGAPDHexpressionlevelsinBMof108ALsand23non-leukemiasbyLightCycler.NormalizedWT1expressionlevel（WT1N）wasdeterminedasaratiobetweenWT1andGAPDHtimes10<SUP>4</SUP>.Results TheMedianexpressionlevelsofWT1Nin70newlydiagnosedALs and11relapsedAlswerestatisticallyhigherthanthoseof23ALswithcompleteremission（CR） and 23non-leukemic controls（75.10 and 89.56 vs2.07 and 1.51 ）.NostatisticdifferenceswerefoundbetweentheCRgroupandcontrolgroup,norbetweenthenewlydiagnosedgroupandrelapsedgroup.Ofthe 70newlydiagnosedAls,MedianWT1Nexpressionlevelofacutegranulocyticleukemiaswassignificantlyhigherthanthatofacutemonocyticleukemias（M<SUB>3</SUB>），buttherewerenostatisticdifferencesamongtheM<SUB>1</SUB>,M<SUB>2</SUB>,M<SUB>3</SUB>and ALL subtypes.Furthermorethe WT1Nlevels werenotcorrelatedto WBCcounts ofperipheralblood,blastratioofBMandmultidrugresistantgene（MDR1）expressionatpresentation,butcorrelatedtochromosometypes.DynamicsofWT1Nlevelsof2patientsduringtreatmentshowedthatWT1expressionlevelscouldprognoserelapse.Conclusion WT1expressionlevelsinALswerestrikinglyhigherthaninnon-leukemiaswhowereundectableorlowerexpression.WT1canbeamarkerfordetectingMRDandevaluatingtherapyefficacyinleukemias.<BR>[keywords] leukemia,acute;WT1;RT-PCR;real-timequantitative
WT1（Wilms’tumorgene,WT1）定位于11p13，是最早发现与Wilms’肿瘤发生、发展有关的基因。WT1主要在胚胎发生过程中表达，对泌尿生殖系统的发育起重要作用，在成人，WT1仅在肾脏、卵巢、子宫内膜、睾丸、脾脏、乳腺及正常造血祖细胞微量表达[1]。研究发现几乎所有的白血病原始细胞（无论系别）都持续过表达WT1，与其在极少数生理性造血干细胞（CD34）中短暂低表达形成鲜明对比，定性和半定量RT-PCR法在区别单个核细胞WT1是生理性还是病理性表达存在缺陷和限制，WT1作为“泛白血病标志”（panleukemicmarker）在急性白血病中的表达及预后意义是一个有争论的问题[2]，为进一步准确检测，我们采用实时定量RT-PCR技术检测了108例急性白血病患者骨髓中WT1的表达水平，报道如下：
对象与方法
1研究对象所有的白血病患者均来自苏州大学附一院及附三院血液科2002年3月~2003年10月门诊或住院治疗的患者，男62例，女46例，年龄6岁~72岁之间，中位年龄36.5岁。白血病的诊断均经临床、血象、骨髓象及组织化学染色、免疫分型、染色体检查确诊，部份患者行融合基因检测，符合白血病MIC分型。其中AML95例（M02例，M120例，M238例，M318例，M47例，M510例），ALL13例。对照组23例，为同期就诊非白血病患者（过敏性紫癜，缺铁性贫血，免疫性血小板减少性紫癜，巨幼细胞性贫血，淋巴瘤）及健康供者CD34细胞。以WT1高表达的K562细胞作为阳性对照。
2主要试剂TRIzol总RNA提取液购自GibcoBRL公司，逆转录酶M-MLV购自Promega公司，TaqDNA聚合酶购自上海申友公司。
3骨髓单个核细胞分离：常规抽取患者骨髓液2~5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（Ficoll分离液）分离单个核细胞，计数（5~10）×106细胞加TRIzol总RNA提取液1ml，混匀后-20℃冻存（时间小于2月）用于RNA制备。
4RNA提取及定量：采用TRIzol一步法提取骨髓单个核细胞总RNA，紫外分光光度仪测定OD
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