颅内动脉瘤信号传导相关基因的筛选

作者：石忠松，李明昌，孙毅明，朱永华，戴华浩，潘伟生，黄正松

【摘要】　　【目的】基因芯片技术建立颅内动脉瘤患者血液单核细胞基因表达谱，筛选与信号传导相关的基因表达情况。【方法】50例颅内动脉瘤患者外周血，10例正常成人作为对照组，分离血液单核细胞，提取总RNA，与含22215个人类基因的Affymetrix寡核苷酸基因芯片杂交、洗脱、染色和扫描，分析检测的数据。荧光定量RT-PCR验证芯片结果。【结果】检测的22215个基因中，颅内动脉瘤共差异表达的基因有325个，差异水平均达2倍以上的基因有35个，生物信息学分析发现信号传导相关基因有7个，其中上调基因5个，下调基因2个。【结论】血液单核细胞基因表达谱是研究颅内动脉瘤发病机制的新策略，多个信号传导相关基因参与颅内动脉瘤的形成和发展。

【关键词】颅内动脉瘤;白细胞，单核;基因表达谱;信号传导；基因芯片

Abstract:【Objective】Toidentifysignaltransduction-relatedgenesinperipheralbloodmononuclearcellsfromintracranialaneurysmpatientsusingoligo-microarrays.【Methods】Bloodsamplesfrom50intracranialaneurysmsand10healthyhumandonorswereobtainedafterinformedconsent.Peripheralbloodmononuclearcells（PBMC）wereisolatedfrombloodusingFicollmethod.ThecDNAwereretrotranscribedfromtheextractedRNAandthebiotin-labeledcRNAderivedfromthetranscriptionofcDNAwerefragmentedasprobes.Then,theprobeswerehybridizedwithAffymetrixHumanGenomeU133AArray.GeneArrayScannerwasusedtoscreenthesignalsofhybridizationandMicroarraySuitesoftware5.0wasappliedtoanalyzetheexpressionofgenes.【Results】Therewere325genesdifferentlyexpressedinPBMCsfromintracranialaneurysmpatientscomparedtohealthyhuman.Functionanalysiswereconfirmedfrom21upregulatedgenesand14downregulatedgenesabove2-foldlevel.Amongthesegenes,thereare7genesinvovledinsignaltransduction.【Conclusions】ThemethodologiesofgenechipofPBMCswillprovideanewpowerfulapproachtoidentifythemolecularmechanismsofintracranialaneurysm.SignaltransductionmaybethepossiblemechanismforthepathogenesisofintracranialaneurysmsinChinese.

Keywords:intracranialaneurysm;leukocytes,peripheralbloodmononuclearcell;geneexpressionprofile;signaltransduction;genechip

近年基因芯片技术在人类疾病诊断、发病机制及疾病易感性研究中起到重要作用[1]，在血管性疾病如主动脉瘤的发病机制研究中也逐渐有应用基因芯片技术的报道[2]。颅内动脉瘤的发病机制目前尚不明确，我们前期对手术切除的颅内动脉瘤组织标本进行基因芯片研究，初步建立国人颅内动脉瘤组织基因表达谱[3]。本研究利用来源较充足的血液遗传信息库，进一步探讨国人颅内动脉瘤患者外周血单核细胞（PBMC）基因表达谱，发现了一些颅内动脉瘤可能致病相关基因群，其中多个基因与信号传导机制密切相关，为阐明颅内动脉瘤的发生机制和寻求早期诊断分子标记物提供了新线索，现报告如下。

1材料和方法

1．1颅内动脉瘤患者PBMC的分离

50例患者均经数字减影脑血管造影诊断为颅内囊性动脉瘤，年龄32～63岁，男性24例，女性26例，分别采集其2mL外周血。每10例患者随机组合为一组，另取10名体检正常的成人健康志愿者作为对照组，每组将已分离的PBMC混合后提取RNA。Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，简述如下：2mL外周血加入EDTA抗凝剂，用半径为16cm的水平离心机以1500r/min离心20min，弃上清血浆，加入2mL淋巴细胞分离液，1500r/min离心20min，吸取中间层的单核细胞，1500r/min离心5min，去上清后加入0.3mLRNALater，－80℃保存用以抽提RNA。

1．2试剂、基因芯片及主要设备

TRIzol试剂盒、RNeasyMiniKit（Qiagen公司，德国）、T7-（dT）24引物、dNTP（Promega公司，美国）、SuperScriptⅡ逆转录酶（Invitrogen公司，美国）、DNAligase、DNA多聚酶Ⅰ、RNA酶H（Invitrogen公司，美国；MEGAscriptT7InVitrotranscriptionKit（Ambion公司，美国）；HumanGenomeU133Aarray（Affymetrix公司，美国）；GeneChiphybridizationOven640（Affymetrix公司，美国）、GeneChipFluidicsStation400（Affymetrix公司，美国）、GeneArrayScanner（Affymetrix公司，美国）、MicroarraySuiteVersion5.0分析软件（Affymetrix公司，美国）等。

1．3基因芯片的方法[4,5]

HumanGenomeU133Aarray芯片包含人类基因组中的22215个已知或未知基因和EST片段。按TRIzol试剂盒说明从PBMC样本中抽提总RNA，RNeasyMiniKit纯化，1％DEPC水溶解后在紫外分光光度仪下测定RNA的浓度和纯度，同时凝胶电泳检测RNA有无降解。按SuperScriptⅡ试剂盒操作说明反转录成cDNA，并以Affymetrix公司的RNATransciptLabelingKit进行体外转录合成cRNA探针及生物素标记。

合成后的cRNA探针经片段化处理后加入基因芯片内，置入杂交炉640中45℃杂交16h，然后在基因芯片流程工作站400中洗脱、染色。为了确保芯片检测结果的可靠性，片段化后的cRNA探针先与一张检测芯片（testchip）进行杂交，经GeneArrayScanner扫描和数据分析，确认所用cRNA探针质量可靠后再与HumanGenomeU133Arealchip杂交。

1．4基因芯片检测数据的处理

GeneArrayScanner扫描杂交后的芯片，存为*.DAT图片文件，并经标准化存为*.CEL图片文件。MicroarraySuiteVersion5.0软件进行杂交结果分析，将检测报告生成*.CHP报告文件，并将基因检测结果转换成*.xls文件。动脉瘤组基因表达谱与正常对照组进行比较，生产散点图和差异表达基因的*.xls文件，最后将*.xls文件中的基因探针号登陆Affymetrix网站（www.affymetrix.com）进行批处理查询（BatchQuery），得出探针相对应的基因及相关信息。

1．5荧光定量RT-PCR

随机选取3个差异表达的基因，即CDKN1C、MNDA、MAPK14，以?茁-actin作为内参照，根据Genebank序列号获取全长cDNA序列，由上海生工生物技术有限公司合成，行荧光定量RT-PCR检测上述3个基因的表达情况，验证芯片结果的准确性。引物序列如下：CDKN1C：5′-ACGGCTCAGGAACCATTTTA-3′，3′-actgaacctgaccgtacaCTGCCATACATGCCCATCTA-5′；MAPK14：5′-TGCCGAGCCAGTCCAAAA-3′，3’-actgaacctgaccgtacaCCAAATTCTCCGAGGTCTAAA-5′；MNDA：5′-TCCACTCCCCACTACATCCA-3′，3′-actgaacctgaccgtacaGTCAACTTTACAAGCAAGCATCT-5′；探针为含actgaacctgaccgtaca（Z序列）的Amplifluor引物特异性荧光标记探针（Intergen公司）。

采用RotorGene3000型荧光定量PCR仪（Corbett公司）进行定量检测，总反应体系中，含逆转录产物cDNA3μL，10×buffer3μL，HotstarTaq酶（3U/μL）0.3μL，dNTPs3μL，含Z序列引物3μL，不含Z序列引物1.5μL，Uniprimer3μL，DH2O11.4μL。反应条件：95　℃15min预变性，95　℃20s，54　℃30s，72　℃30s共55次循环。产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。梯度稀释后制作标准定量曲线，计算机RotorGene6.0分析软件自动地计算出最适合的标准曲线方程式，并根据域值算出各样品Ct值与拷贝数。将各个样品中目的基因拷贝数与β-actin拷贝数比较，得到校正值。各个样品的校正值与对照组样品比较得到实验结果。

2．1外周血RNA的浓度和纯度

采用TRIzol试剂盒从颅内动脉瘤患者和健康志愿者PBMC样本中抽提的总RNAA260/A280比值均在1.9～2.1之间，电泳显示28S和18S两条清晰的条带（图1），后带荧光亮度大约是前带的2倍且无明显的拖尾现象，两者比值约为2∶1，证实提取的RNA无降解、完整性佳，可用于下一步的基因芯片检测。

2．2检测芯片的质量情况

颅内动脉瘤患者外周血和健康志愿者外周血中的cRNA与检测芯片（testchip）杂交后的扫描图检测报告表明，杂交芯片的背景值（backgroud）、噪音值（Noise）均匀，管家基因对照（Housekeepingcontrols）中的β-actin和GAPDH的3′端和5′端的信号比值均低于3.0的标准；外加的阳性对照信号值逐渐升高。这些情况说明，基因芯片和样品RNA的质量良好，杂交反应体系正常，芯片检测的结果可靠，可依此进入U133A杂交检测流程。