复明片对兔视网膜脱离后视网膜色素上皮细胞增殖的影响

作者：刘娉，彭清华，李建超，彭抿，吴大力，张波涛，杨霞

【摘要】目的研究复明片对兔实验性视网膜脱离后视网膜色素上皮细胞（retinalpigmentepithelium,RPE）增殖的影响。方法用有色家兔96只设正常对照组（A组），制作视网膜脱离模型后分模型组（B组）、西药对照组（C组）、复明片组（D组）。并于造模后7、14、21d分别取视网膜组织制备细胞悬液，流式细胞仪检测各兔增殖细胞核抗原（PCNA）在视网膜神经上皮层的表达。结果脱离后视网膜神经上皮层PCNA阳性细胞表达均呈上升趋势，7d后开始下降，且复明片组相较其余各组比较均有统计学意义（P<0.05）。结论复明片通过恢复视网膜色素上皮与神经上皮之间的接触，阻止RPE的增殖即PCNA的表达。

【关键词】复明片；视网膜色素上皮细胞；增殖细胞核抗原；流式细胞仪；兔；黄芪；生地；茯苓

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕ＯｂｊｅｃｔｉｖｅTostudytheeffectofFumingtabletonproliferationofretinalpigmentepithelium（RPE）inrabbits'eyeswithretinaldetachment（RD）.Method96healthyadultcolouredrabbitswererandomlydividedintofourgroups:blankgroup（groupA）,modelcomparativegroup（groupB）,westernmedicinetreatinggroup（groupC）andFumingtablettreatinggroup（groupD）.Thecellsuspensionswerepreparedwithretinaltissuesgainedat7th,14thand21thdayaftermodeling,andtheexpressionofproliferatingcellnuclearantigen（PCNA）inretinalneurosensorylayerwasexaminedbyflowcytometry（FCM）.ResultTheexpressionofPCNAincreasedinthefourgroupsafterdetachment,whileitbegantodecreaseafter7thday,andtheexpressioningroupDwassignificantthanthatinothergroups（P<0.05）.ConclusionFumingTabletcaninhibittheexpressionofPCNAbythecontactofbothretinalneurosensorylayerandretinalpigmentepitheliumlayerwasrecoveredbysowasprevented.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕Fumingtablet;retinalpigmentepithelium;proliferatingcellnuclearantigen;flowcytometry;rabbits;Radixastragali;Rhizomeofrehmannia;Poriacocos

视网膜脱离（retinaldetachment,RD）是指视网膜色素上皮与神经上皮之间的分离，是严重的致盲眼病，可导致眼球萎缩。在众多致盲因素中占第5位，14岁以下儿童占第4位[1]。视网膜脱离手术后的解剖复位率达95％以上，但术后视功能恢复仍不理想。目前，尚缺乏能应用于临床的有针对性的药物。寻求能改善视网膜脱离手术后增进患者视功能的辅助治疗，是临床上亟待解决的问题。

1材料与方法

1.1.1动物成年健康有色家兔96只，体质量2.0～2.5kg，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第20-003号。

1.1.2药品复明片：由黄芪、生地、茯苓、车前子、地龙、赤芍、红花、白术等中草药按现代制剂制备工艺制成，0.3g/片，选用同一批号药物，批号：040208。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时去掉糖衣，研成粉末，温开水混合，配制成浓度为10%的混悬液；三磷酸腺苷二钠片（AdenosineDisodiumTriphosphateTablets,ATP）：20mg/片，福建古田药业有限公司生产，批号：050827-1；维生素B1（VitaminB1，VitB1）：10mg/片，湖北华中药业有限公司生产，批号：20050801；维脑路通：60mg/片，山西晋新药业集团有限公司生产，批号：050811，使用时研成粉末，温开水混合，配制成每升水含VitB11276mg、ATP1102mg、维脑路通734mg的溶液；透明质酸酶：上海第一生化药研所生产，批号：20050901。

1.1.3仪器OPTON多功能显微镜（德国OPTON公司生产）；Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS公司生产）；双目间接眼底镜（美国WelchAllyn公司生产）；Topcon眼科手术显微镜（日本TOPCON公司生产）；眼底接触镜（苏州医疗器械有限公司生产）；eppend-orf5804R/5810R型高速冷冻离心机（德国SIGMA公司生产）；Beckmancoulter流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司生产）。

1.1.4试剂PCNA测试盒（武汉博士德生物工程有限公司生产）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产）。

1.2.1兔眼视网膜脱离模型建立依照文献[2]等提出的方法，并加以改进。术前3d用0.25％氯霉素眼药水和1％阿托品眼药水交替滴眼，3次/d。手术当日生理盐水冲洗结膜囊，术前滴1％丁卡因眼药水2~3次。造模时术眼（均取右眼）采用10%新福林和1%阿托品散瞳。3%戊巴比妥耳缘静脉注射（1mL/kg）麻醉后，将兔固定于手术台上，庆大霉素加生理盐水混合液冲洗结膜囊，常规消毒铺巾、开睑。点丁卡因表面麻醉，方筋膜下注入2％利多卡因0.2mL形成泡状隆起，沿角膜缘环行剪开鼻侧球结膜和筋膜，向后稍分离，暴露赤道部巩膜，距角巩缘后5mm睫状体平坦部用25GB-D针头垂直眼球壁刺穿巩膜，在眼底接触镜和显微镜直视下观察到伸入玻璃体内的针尖，将10IU/mL透明质酸酶溶液0.1mL缓慢注入到玻璃体的中央偏后部，拔针后压迫注射点3min。15min后再由原穿刺口将自制视网膜下腔注射针头缓慢探进，反复抽吸0.1mL液化的玻璃体，在眼底接触镜和显微镜直视观察下小心地把针尖引向后极部，避开视网膜血管，在颞侧距视乳头1个视盘直径（PapillaDisc,PD）放射状视网膜处刺穿视网膜，进入视网膜下腔，助手缓慢推动注射器，注入液化的玻璃体液0.1mL，可见视网膜被分离，脱离的视网膜呈大片灰白色隆起，范围约1/2个PD大小，退出针头，角膜缘处放出房水以降低眼内压。术后铺平球结膜，结膜囊涂0.5%四环素眼膏，结膜下注射庆大霉素加地塞米松0.1mL，肌肉注射庆大霉素0.8万u，以防感染，术后1周每天用氯霉素眼药水点眼4次，并一直给1%阿托品眼液散瞳。

1.2.2给药方法造模后第1天下午开始给药，A组（正常对照组）与B组（模型对照组）均予温开水灌胃，5mL/kg，每日1次；C组（西药对照组）予西药混合溶液灌胃，5mL/kg，每日1次；D组（复明片治疗组）予复明片混悬液灌胃，5mL/kg，每日1次。

1.2.3标本制备、细胞悬液制备方法及流式细胞检测于造模后7、14、21d，各兔用3%戊巴比妥耳缘静脉注射（1mL/kg）麻醉，摘除眼球，生理盐水冲洗干净。在冰生理盐水中，沿角巩缘剪开眼球达360度，弃角膜、晶体、玻璃体，保留视网膜连同脉络膜巩膜组织，取出视网膜于定量滤纸上加少许0.01MPBS（pH7.2~7.6）液，用显微剪均匀剪碎，制备细胞悬液，75%乙醇固定，4℃冰箱保存备用。收齐样本后取细胞悬液1000r/min离心7min，弃上清后加入75%乙醇混匀固定。测试当日加含10%的胎牛血清1mL室温下放置20min后0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗2次，每次3min，1000r/min离心7min，弃上清。阳性组加入PCNA1∶50配比50μL每管，阴性对照组加PBS液50μL每管，4℃过夜。0.01MPBS洗3次，每次5min，1000r/min离心7min，弃上清。1∶200异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate，FITC）标记二抗，室温孵育2h，0.01MPBS洗3次，每次5min，1000r/min离心7min，弃上清。加入0.01MPBS800μL，应用FACSCalibur型（BectonDickinson公司）流式细胞仪检测PCNA阳性细胞百分数。每次检测都设有空白对照及正常对照，每时间点检测3~5次，取平均值。

1.3统计方法

用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理，所有实验数据以均数标准差（ｘ±ｓ）表示。

脱离后视网膜神经上皮层PCNA阳性细胞表达均呈上升趋势，7d后开始下降。7d时模型组、西药对照组、复明片组、正常对照组各组间差异均有统计学意义；14d时除复明片组与西药对照组其余各组比较差异均有统计学意义；21d时除复明片组与正常对照组及复明片组与模型组外，其余各组比较差异均无统计学意义。见表1。

3.1中医对视网膜脱离的认识及治疗

在祖国医学文献中无“视网膜脱离”病名，根据其临床表现，可归属于“暴盲”、“神光自现”等范畴，为“外不见证，从内而蔽”的内障眼病。中医文献上的某些记载，与本病颇为相似，如《证治准绳・七窍门》中：“谓目外自神光出现，每如电光闪掣，甚则如火焰霞明，时发时止，……乃神光欲散，内障之重者”；《抄本眼科》“落气眼”一症：“忽然眼目黑暗，不能视见，白日如夜，此症乃元气下陷，阴气上升”；《目经大成》也有“电光夜照”症状的记载。传统中医学认为,视衣（视网膜）为瞳神深部组织,RD属内障眼病,属于瞳神疾病范畴；瞳神称水轮,在脏属肾,视网膜是大脑的延伸部分,肾生髓于脑,故视网膜的病变与肾密切相关。肝胆互为表里,肝肾同源,肾藏精而肝藏血,目得精血之养才能视觉灵敏,故肝肾不足,精血亏虚,常为视网膜病的重要病因病机;又肝主疏泄,肝郁则气滞,气滞则血瘀,视网膜病变亦常与此有关;脾为后天之本,气血生化之源,主运化水湿,脾虚气血不足,目失所养或水湿上泛是视网膜发生变性、水肿、渗出或增殖的重要病机。故视网膜、玻璃体的病变与肝、胆、肾、脾等脏腑功能密切相关[3]。视网膜脱离产生之原因，多为患者气虚不固致视网膜不能紧贴球壁而脱落；而视网膜脱离手术是一种人为的眼外伤，术后多有瘀血病理存在，有时术中还可致视网膜出血；本病术中无论放水与不放水，其术后多有网膜下积液存留；而术中不可避免之出血又可使眼部阴血亏虚。