旋毛虫病的检测方法

旋毛虫病的检测方法首席医学网2008年05月22日16:07:29Thursday中华临床医师杂志征稿内科临床新进展研讨班重症与血流动力学大会血液净化技术学习班医学类核心期刊征稿第六届世界中医药大会2009世界高血压大会第四届中国国际白血病急危重病护理交流会IOF亚洲骨质疏松班2009年中国药学大会医学影像学术交流会结直肠肛门外科会议口腔正畸学术会议征稿广东研究生学术论坛

作者：王永千王辉杨勇作者单位：吉林省榆树市弓棚农村中心医院吉林大学人兽共患病研究所

【摘要】旋毛虫病是一种重要的人兽共患病，其检测方法主要有：检测病原法、免疫学诊断和DNA检测法，文章就多种方法进行逐一论述。

【关键词】人兽共患病检测方法

　　旋毛虫病（trichinosis，trichinellosis）是由旋毛线虫（Trichinellaspiralis）引起的人畜共患的寄生虫病，流行于哺乳类动物间，人因生食或半生食含旋毛虫包囊的猪肉等而感染。临床表现为胃肠道症状、发热、肌痛、水肿和血嗜酸粒细胞增多等。我国自1881年在厦门发现旋毛虫病以来，目前已有26个省（市、区）有关于旋毛虫病流行的报道。临床上，旋毛虫病确诊主要靠检测病原和实验室检查和DNA检测法。现就旋毛虫的检测方法作一综述。

　　1检测病原　　常用的检测病原方法有活组织压片镜检和消化法。

　　1.1镜检法感染后第四周取三角肌或腓肠肌（或浮肿，肌痛最显著的部位）近肌腱处肌肉一小片，置两玻片中压紧，低倍镜下观察，可见蜷曲的幼虫，虫体周围有多数炎性细胞包绕，形成小型肉芽肿。

　　1.2消化法感染较轻镜检阴性者，可将肌片用胃蛋白酶和稀盐酸消化，离心沉淀后检查幼虫，其阳性率较压片法为高。压片镜检法检出率仅50%左右［1］，消化法可比压片法提高检出率20%。这两种方法有摘取组织的局限性，在感染的早期及轻度感染者检出率低，实施时病人不易接受等缺点，使用范围受到限制。

　　2免疫学诊断　　根据其解剖结构，旋毛虫抗原可分为四部分：虫体抗原、表面抗原、杆细胞颗粒相关抗原以及排泄／分泌抗原（ES抗原）。国内外试用过多种免疫学检查方法，包括皮内试验、补体结合试验、凝集试验、环蚴沉淀试验、对流免疫电泳、间接荧光抗体试验（IFA）、间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及间接免疫酶染色试验（IEST）等。其中后四者的特异性强、敏感性高，且可用于早期诊断。

　　2.1皮内试验自Maynard等［2］于1964年发现用旋毛虫幼虫抗原对旋毛虫病患者作皮内试验可以产生阳性反应以来,从此将皮内试验作为旋毛虫病的辅助诊断方法。我国曾宪荣等用旋毛虫幼虫制成可溶性抗原,于1979～1980年在西藏地区对旋毛虫现症患者进行皮试。证明皮内试验对诊断旋毛虫病有较高的敏感性和特异性。朱名胜等［3］用皮肤变态反应试验诊断31例旋毛虫病人,阳性率100%;交叉试验,结果与蛔虫病、鞭虫病、钩虫病、肠毛滴虫病无交叉反应。该方法操作简单、反应快速且不需特殊的仪器设备。用于人体时，在15分钟后即可观察结果，对于猪体则需30～45分钟。但皮内试验存在着明显的不足，不但有严重的假阳性反应和交叉反应，而且只能检出60%的感染，同时该法不能区别病后康复和患者。所以近几年来很少使用。

　　2.2补体结合试验（CF）Witebsky等1942年首次将CF用于人的旋毛虫病诊断。因为并非所有的抗体均能固定补体，所以CF只能检出一部分旋毛虫抗体。另外，CF操作复杂，费时费力，而且不同实验室之间的检测结果差异很大。因此，用CF诊断旋毛虫病受到了限制。

　　2.3凝集试验凝集反应是将可溶性抗原吸附于某些载体表面，然后用吸附抗原的载体颗粒与血清抗体进行间接凝集试验，以检测旋毛虫病。目前可用于旋毛虫病检测的凝集试验有：皂土絮状凝集试验（BFT），胶乳凝集试验（LAT）和间接血凝试验（IHA）等。王绍基等［4］采用间接红细胞凝集试验（IHA），检测感染旋毛虫病豚鼠血清，阳性率为100%。EissaMM等［5］应用协同凝集试验（Co-A），对旋毛虫感染实验小鼠尿样和血样进行检测，均检到旋毛虫抗原，这种方法的检测结果与ELISA法一致。其特征是操作简便，反应快速，敏感性高；缺点是容易发生非特异性反应。所以在做凝集试验时，必须设置阴性血清、阳性血清和生理盐水等对照，以排除非特异性凝集。

　　2.4沉淀试验Olivert-Gonzalez（1941）等报道用含有特异性抗体的血清孵育幼虫，可使虫体天然孔周围出现泡沫样或颗粒状沉淀物，此即为微量沉淀试验或环幼沉淀试验，该方法对人旋毛虫病的检测结果阳性符合率为９５％以上，特异性高，而且方法简便，利于快速诊断；环蚴沉淀试验对诊断早期旋毛虫病非常有用，但对慢性感染则无诊断价值。

　　2.5对流免疫电泳该法事先将抗原在凝胶板中电泳，之后在凝胶槽中加入相应抗体，抗原和抗体双相扩散后，产生肉眼可见的弧形沉淀线。Despommier等首先将对流免疫电泳（CIE）用于人旋毛虫病的诊断，所用的抗原为部分纯化的肌幼虫抗原，与BFT阳性符合率为90.38%。

　　2.6间接荧光抗体试验（IFA）间接荧光抗体试验（IFAT）较早用于诊断旋毛虫病，初期用全虫作抗原，后来发展为虫体或带虫肌肉切片作抗原。患者于感染后2～7周可出现阳性反应。王中全等［6］应用旋毛虫幼虫冰冻切片抗原，以IFAT检测216份旋毛虫病人血清，抗体阳性率为90.74%，发病后第1周抗体阳性率70.59%，第2周升至91.30%，有显著差异（P＜0.025），至第3、4周分别达95.83%和100%。旋毛虫幼虫抗原片在-20℃至少可保存2.5年而不失活。

　　2.7间接红细胞凝集试验（IHA）IHA用冻干致敏绵羊红细胞、以IHA检测患者血清中抗体。用滤纸干血滴代替血清，结果无显著差异，朱名胜等用IHA方法检测感染旋毛虫豚鼠血清，阳性率为100%。检测35份正常豚鼠血清，20份血吸虫病兔血清,30份肺吸虫病大白鼠血清，25份蛔虫病人血清和12份鞭虫病人血清，除1例肺吸虫病大白鼠血清出现交叉反应外，其余均为阴性。结果表明操作简便的IHA法具有较高的敏感性和特异性，适用于流行病学调查。

　　2.8酶联免疫吸附试验（ELISA）70年代发展起来的ELISA现已广泛用于细菌、病毒和寄生虫感染的血清学诊断，美国学者Gamble等［7］首次采用ELISA检测猪旋毛虫ES抗原，显示可检出虫荷低至0.01条幼虫0.01／g肌肉的水平，认为使用该抗原具有较高的敏感性；这种方法适合用于检测血清中的特异性IgG。Murrell等［8］以肌幼虫ES为抗原，利用ELISA方法检测旋毛虫感染猪，阳性率为98%，假阳性率小于3%。陈雅棠等［9］用ELISA检测11例旋毛虫病人血清特异抗体，阳性率为72.72%，与献血员组和其它寄生虫病人组相比均有显著差异，表明此法具有较好的特异性和灵敏性。该法是目前公认的检测旋毛虫特异抗体的较好的方法。国外已将检查旋毛虫的ELISA方法作为猪只屠宰前的常规检查。我国经过长期实践，实验技术也得到了不断地改进，已从常规的ELISA发展为SPA-ELISA、DOT-ELISA等，旋毛虫ELISA诊断试剂盒也研究成功并推广试用。现今ELISA已广泛应用于旋毛虫病的流行病学调查和临床诊断。但是ELISA也有缺陷：其操作相对较繁琐且要求的实验条件也较高，基层应用尚有一定困难。

　　2.9免疫酶染色试验（IEST）用感染鼠肌肉冰冻切片作抗原，以IEST检测患者血清中抗体。血清学试验于感染后2～4周开始阳性，感染后7周多全部阳性。反应如由阴性转为阳性，或抗体效价4倍升高者尤有诊断价值。血清学检查在抗体检测上取得良好效果，但人、畜感染旋毛虫后，抗体持久存在于血清中，不利于疗效考核。近年国内外已成功地制备旋毛虫幼虫单克隆抗体。采用虫体可溶性抗原、排泄分泌抗原结合单克隆抗体、多克隆抗体-间接双抗体夹心ELISA法检测患者血清中循环抗原，抗原阳性结果提示为现症感染，且具疗效考核价值。IEST对旋毛虫病特异性抗体的检测具有较好的敏感性和特异性又有操作方便不需要特殊仪器等优点且抗原片可长期保存研究。其缺点是较复杂，不宜操作等。

　　2.10增强化学发光酶免疫染色试验（ECIA）ECIA是近年才发展起来的一项新技术，它基于与抗体连接的酶能使底物（发光素）产生发光的原理，当在底物中加入增强剂后，可使底物的发光强度增大2500倍。Ko等［10］首次将ECIA用于诊断旋毛虫病。他们用旋毛虫排泄分泌抗原和虫体粗抗原,分别包被特制的作为固体支持的磁性小珠，用牛血清封闭后，将小珠分别放入9×7孔的测试板内，然后依次加入待检血清、酶标抗体发光底物，用“拍立得”底片记录试验结果。结果显示ECIA用排泄分泌抗原比用虫体粗抗原可获更高的特异性，并可减少假阳性。在诊断旋毛虫病时，ECIA具有与ELISA相似的特异性和敏感性，且容易获得相片记录，全过程仅需45min，因而适用于屠宰场猪的大规模检测和流行区现场筛选。但磁性小珠价高是影响该法推广的一大障碍。

　　2.11循环抗原的检测循环抗原的检测是近年来寄生虫免疫诊断的研究热点，已在10多种寄生虫感染中检出。Smith等用双向对流免疫电泳检测旋毛虫感染小鼠血清中循环抗原和抗体，在感染后12d就有抗原检出。Choy等［11］比较了8种检测旋毛虫抗原的免疫学方法的敏感性，其中ELISA可检出低于0.5Lgml的循环抗原。Ivanoska等［12］用竟争性放射免疫法检测63例具有典型旋毛虫病症状患者的循环抗原，阳性率为47%。张月清等［13］用双抗体夹心ELISA法检测病猪血清54份，循环抗原阳性率达61.1%，且在感染后每3d即呈阳性反应。

　　3DNA检测技术　　PCR是上个世纪80年代中期发展起来的一种在体外迅速大量扩增特异性DNA的新技术，它具有高度的灵敏性和特异性。目前，已有许多学者把PCR方法应用于旋毛虫病的实验室检测。Caballero-GarciaML等用PCR方法对实验感染小鼠进行旋毛虫病早期诊断，结果最早在感染后第3天检测到旋毛虫DNA，在第3～17天，33只实验鼠血样中均检测到旋毛虫DNA。张国华等［14］根据旋毛虫幼虫1.6kb基因序列而设计合成引物，以PCR检测含鼠旋毛虫幼虫及纯幼虫。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出了特异的670bp与500bp大小的DNA带，而正常肌肉对照未见扩增出此带。本法可检测0.01条幼虫产物，具有高敏感性和特异性。但由于旋毛虫本身及其在宿主体内寄生部位的特殊性，难以在生前从被感染动物的血清、组织液中扩增到旋毛虫DNA，故利用PCA基因检测技术对旋毛虫病生前检测受到限制。　　虽然旋毛虫的检测方法很多，由于旋毛虫虫体抗原的结构极其复杂，且在其长期的寄生生活中，逐渐形成了各种各样的免疫逃避手段，采用成分复杂的虫体抗原往往难以取得理想的诊断、预防和治疗效果。近年来，为解决上述方法的弊端，国内外学者把视线放在基因工程抗原上，通过构建cDNA文库，筛选理想的抗原，预测其抗原表位。探索应用旋毛虫重组抗原进行快速、广普旋毛虫检测的新方法。

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