1.直肠肌层活检 Swenson(1955)最先采用该法，准确率为98％。从直肠壁取肌层活检，证实肌间神经节细胞缺如诊断先天性巨结肠，理论上是最可靠的方法，但因存在一些缺点，故目前并非必要：⑴Smith(1968)经组织学检查发现，生后神经节细胞有一发育和成熟过程，直肠肌间丛尤其明显，黏膜下丛又落后几周，如不注意，可把正常儿诊断为先天性巨结肠或同源病。⑵正常直肠在齿状线上方有一低神经节细胞区，在该区内取材可把正常儿诊断为先天性巨结肠或同源病。故强调取材高度在齿状线上方,至少新生儿2cm，1岁以内2.5cm，1～3岁3cm，4岁以上3.5cm，如此，短段型巨结肠病儿又易漏诊。⑶小儿肌层活检有肠穿孔、出血、感染等并发症，术后瘢痕可影响根治性手术；新生儿因肛管狭小、直肠壁薄、操作不便等，更易发生并发症。⑷另外，肌层活检是诊断先天性巨结肠同源病的主要根据。2.直肠黏膜活检 直肠黏膜活检仅吸取一小块黏膜。经不断改进，该法简单、安全可靠，可不需麻醉，不必住院。检查方法有组织学、组织化学及免疫组织化学。组织学检查主要用HE染色判断神经丛中神经节细胞的有或无。该法简单，但不准确；乙酰胆碱酯酶等组织化学检查方法，需要新鲜组织标本和冷冻切片机等技术条件，新生儿期因乙酰胆碱酯酶活性较低，易出现假阴性结果；免疫组织化学方法准确性高，但因试剂昂贵，目前尚不适于做常规诊断方法。3.其他⑴X线钡剂灌肠 X线下钡剂灌肠是判定病变范围和选择术式的重要依据。钡剂灌肠目的是显示痉挛段及其上方的扩张段，因此确认扩张段即可，不要过多灌入钡剂继续向上检查，以免加重病儿腹胀及其危险。⑵直肠肛管测压 是诊断先天性巨结肠的有效方法，具有经济、简便、快速而安全、无损伤性、可反复检测等优点。
