123456781.λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ2.pcDNA3.1(+)tPA/PstⅠ3.pcDNA3.1(+)tPA/EcoRⅠ4.pcDNA3.1(+)tPA/KpnⅠ+XbaⅠ5.pcDNA3.1(+)/BamHⅠ6.pATA18tPA/KpnⅠ+XbaⅠ7.pATA18tPA/XbaⅠ8.DNAsizestandard
2pcDAN3.1(+)tPA重组体及亚克隆质粒酶切图鉴定：重组质粒pcDNA3.1(+)tPA用PstⅠ，EcoRⅠ，KpnⅠ和XbaⅠ酶切鉴定；pATA18tPA用XbaⅠ，KpnⅠ和XbaⅠ酶切；pcDNA3.1(+)用BamHⅠ酶切，并对重组质粒进行DNA测序分析，测序引物序列为上游；TAATACGACACACTATAGGG；下游：pcDNA3.1reverseprimer:TAGAACGCACAGTCGAGG。2结果pcDNA3.1(+)tPA的各种亚克隆质粒酶切图谱见图2。pATA18tPA经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后，产生2.0kb的t-PA片段。重组质粒pcDNA3.1(+)tPA经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后，出现了5.4kb与2.0kb两个片段；经PstⅠ酶切后出现了78bp,414bp,622bp,2.0bp及4.2kb五个片段；经EcoRⅠ酶切后，出现了472bp及6.9kb两个片段；测序结果证明为全长tPAcDNA;表明tPA已正确组装在pcDNA3.1(+)载体上。3讨论目前，将tPAcDNA导入血管内皮细胞内的主要手段是借助逆转录病毒载体，所用的逆转录病毒载体去掉了编码病毒结构蛋白的反式作用序列，代之以tPAcDNA;其顺式作用序列，包括两端的长末端序列，包装信号，位号等仍然保留，这种含有tPAcDNA的重组病毒只能形成含有病毒外壳的完整病毒颗粒，必须借助病毒包装细胞提供病毒结构蛋白，才能形成具有感染能力的完整病毒，用其感染血管内皮细胞，使t-PAcDNA转录单位进入细胞与染色体DNA整合［4］。据文献报道，含t-PAcDNA的重组病毒中均有内部启动子，故这种载体又称含内部启动子的病毒载体(VIP)［11］。1989年Dichek等构建了一个VIP类的BzNSt载体，因此，载体转染GPE-8L细胞，收集上清液，感染PA-317病毒包装细胞，再次收集含有完整病毒颗粒的上清液，感染绵羊血管内皮细胞，G418筛选阳性细胞克隆，继续培养后，Southern分析证实，BzNSt组血管内皮细胞中含有t-PAcDNA序列，并已整合到基因组DNA中［5］。用酶联免疫吸附法测定t-PA的表达水平，结果显示股静脉内皮细胞为370±8(ng/106cell/24h)，颈静脉为1230±6;颈动脉为660±240;而不含t-PAcDNA的对照组血管内皮细胞均低于5；BzNSt组t-PA活性已比对照组高出30倍［4，5］，如此高水平的t-PA浓度远远超出激活血液中纤溶酶原和纤维蛋白所需的剂量［6］。基因工程改造体细胞后再回输体内已在基因治疗多项方案中得到应用，其不足之处是周期长，操作复杂，成本高，此外，移植用重组逆转录病毒感染的细胞，虽然在临床应用过程中未发现毒副反应，但仍有顾虑［7］。因为这些重组逆转录病毒具有转座作用的长末端重复序列(LTR)，能与靶细胞基因组随机整合，有可能激活原癌基因而导致细胞恶变［8］，也不能排除这些移植细胞在体内再次形成野生型逆转录病毒的可能性，引起宿主的病毒感染［9］。本研究用分子克隆方法，成功地构建了pcDNA3.1(+)tPA真核表达重组体，无形成病毒之虞，另外，真核表达载体在移植细胞内大多以附加体的形式存在，与细胞基因组的整合频率有限［10］，因此，激活原癌基因的可能性几乎可以排除。总之，用分子克隆方法，构建pcDNA3.1(+)tPA真核表达重组体是一种新尝试，为研究基因防治脑梗死等血栓性疾病提供了新工具，新思路。基金项目：国家自然科学基金资助课题(No.39770271)及哈尔滨市学科后备带头人基金资助课题(No.9770218012)作者单位：赵永波150086哈尔滨医科大学第二临床医学院神经科李钰张贵寅医学遗传学研究室关振中心内科参考文献1AlbertsMJ.tPAinacuteischemicstroke:Unitedstatesexperienceandissuesforthefuture.Neurology,1998,51:(Suppl3):53.2FaganSC,MorgensternLB,PetittaA,etal.Cost-effectivenessoftissueplasminogenactivatorforacuteischemicstroke.Neurology,1998,50:883.3SambrookJ,FritschEF,ManiatisT,etal.MolecularCloning2nd.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989：21.4DichekDA,NevilleRF,ZwiebelJA,etal.Seedingofintrovascularstentswithgeneticallyengineeredendothelialcells.Circulation,1989,80:1347.5DichekDA,NussbaumO,DegenSJF,etal.Enhancementofthefibrinolyticactivityofsheependothelialcellsbyretroviral-mediatedgenetransfer.Blood,1991,77:533.6NabelEG,PlautzG,BoyceFM,etal.Recombinantgeneexpressioninvivowithinendothelialcellsofthearterialwall.Science,1989,244:1342.7GrassmanM,RaperSE,KozarskyK,etal.Successfulexvivogenetherapydirectedtoliverinapatientwithfamilialhypercholesterolaemia.NatureGenetics,1994,6:335.8RobinsonHL.Retrovirusesandcancer.ReviewsofInfectiousDiseases,1982,4:1015.9DubenskyTW,CampbellBA,VillarrealLP.DirecttransfectionofviralandplasmidDNAintotheliverorspleenofmice.ProcNatlAcadSciUSA,1984,81:7529.10AcsadiG,JiaoS,JaniA,etal.Directgenetransferandexperssionintoratheartinvivo.NewBiologist,1991,3:71.(1999-06-18收稿1999-10-04修回) （责任编辑：jbwq）
