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贫血
β地中海贫血的基因治疗
2015-12-04
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β地中海贫血的基因治疗
中华血液学杂志chinesejournalofhematology1999年第20卷第10期vol.20no.101999邹奕杜传书关键词：β地中海贫血基因治疗β地中海贫血(地贫)是一种常见的单基因遗传病，迄今已发现100多种突变类型，致使β珠蛋白合成减少或完全不能合成，从而导致过剩的不稳定的α链形成。β地贫临床表现程度各异，但大多数重型β地贫都要靠输血维持生命，一方面给家庭和社会带来巨大的经济负担，另一方面长期输血不能根本治愈患者，并造成一系列与输血有关的疾病，如铁贮积、免疫反应、病毒感染等，最终威胁患者的生命。所以人们寄希望于基因治疗。β珠蛋白基因定位、结构明确，对相应的调控基因了解较清楚，因此β地贫是最早被尝试用于基因治疗的疾病之一。但由于珠蛋白基因的红系组织特异性和发育阶段特异性以及表达调控的复杂性，使其离成功还相当遥远。广义的基因治疗包括直接基因治疗和间接基因治疗。1直接基因治疗对β地贫的直接基因治疗最早可追溯至1980年，当时将正常的β珠蛋白基因直接注入2例β地贫患者的骨髓细胞，然后再回输患者体内，但经过一段时间的临床观察，未取得治疗效果。尽管有了初次的失败，但由于逆转录病毒运载的珠蛋白基因在mel细胞培养体系中的成功表达，以及转入的外源人β珠蛋白基因使β地贫小鼠的症状得到改善，这些都使人们对直接基因治疗充满了信心。但十几年来，由于外源基因在体细胞内表达水平低，达不到治疗效果，能表达外源基因的细胞数少，在跟踪观察中这些细胞还会减少,因此如何提高转化效率，提高病毒滴度和外源基因的表达，纯化可长期增殖、保持其数量的造血干细胞（ltra）,成为人们重新估价β地贫直接基因治疗的主要因素。直接基因治疗的基本模式是：①构建运载目的基因的逆转录病毒载体；②前病毒的dna整合到包装细胞基因组中；③通过选择包装细胞得到有一次性感染能力的高滴度的病毒颗粒；④病毒颗粒感染靶细胞，经逆转录后前病毒dna整合到宿主基因组dna中，目的基因在相应的靶细胞中得到表达［1］。载体的基本结构包括病毒表达、包装、整合的基本序列和目的基因及其启动子和调控序列，而病毒的gag，pol，env编码序列缺失，这样就阻止了野生型病毒的产生，而包装细胞则提供形成病毒颗粒所必需的由这些序列编码的蛋白质。在载体上加入的抗新霉素基因或编码特殊膜表面蛋白的基因，使得可以通过g418培养基或免疫学方法选择能产生高滴度载体的细胞系，然后以高滴度的、整合稳定的重组体感染mel细胞。然而感染的效率，整合过程中的重排，错误剪切等都影响了珠蛋白基因的表达水平。在动物实验中，外源基因很难长期存在并表达［2］，说明感染的细胞中，真正长期增殖,并保持其数量的造血干细胞较少，外源基因的表达水平很难达到内源性鼠βmajor珠蛋白基因的5%。红系特异增强系位点控制区(lcr)的发现和研究为提高珠蛋白基因的表达提供了新的可能性。lcr是由位于β珠蛋白基因簇上游的一系列对dnaseⅰ高敏感的位点组成(hypersensitivesites1～5，hs1～5)［3］，全长超过20kb。lcr具有两种互相独立的作用：增强子作用和位点非依赖作用。在动物试验中，lcr可大大增加外源珠蛋白的表达，并不受整合位点的影响，表达水平只与整合基因的拷贝数有关。除hs1外,其余hs位点均有增强子的作用，5个hs位点能协同增强基因表达的功能。hs2和hs3被认为是最有活性的片段，hs2和hs3上能保证其功能的最小核心部分分别是0.4kb的hindⅲ至xbaⅰ之间的片段和225bp的hphⅰ至fnu4hⅰ之间的片段，但各hs位点间的连接序列对于它们之间的协同作用是不可缺少的。β珠蛋白lcr这两种作用的作用机制都尚未清楚。在转基因鼠中，lcr调控元件中不同的hs位点赋予了基因不同的表达模式［4］，hs3似乎与胚胎型ε珠蛋白基因表达相关，hs4与β珠蛋白基因表达相关。louis-guy等［5］在将βlcr与lacz基因顺式连接的转基因鼠的试验中发现，lcr增强基因表达的作用并非如以前研究［6］认为的那样通过二元机制（即有或无）的方式起作用，而是以一种渐变的作用方式增强基因表达,而其位点非依赖作用的实现则需要至少3个以上的hs位点及β珠蛋白基因簇附近的侧翼序列。lcr究竟是改变了染色体的结构而导致染色体特定部位的开放，还是封闭了整合位点周围基因的负性效应,这些问题仍在研究之中。但βlcr严重影响病毒重组体的滴度，导致缺失和重排。有研究表明，β珠蛋白基因ivs-ⅱ中的a/t丰富区与341bp5′hs2中的a/t丰富区有协同作用［7］，能降低病毒滴度和整合稳定性。因此如何去除βlcr中影响病毒稳定性的序列，而又不影响其活性也是当前载体构建中的一大难题。1996年ren等［8］构建的n2a-γ载体含有人γ珠蛋白基因和αlcr(主要包含255bp的hs40)，此n2a-γ载体在5′与3′端的ltr(longterminalrepeats)内均含有αlcr，这样αlcr可以从两边消除整合位点附近的干扰。此载体感染3种包装细胞：gp+envam12、pa317和gp+e86均获得较高滴度，重组率在3个细胞系均小于25%，在mel细胞中，γ珠蛋白基因也有较高表达。除了逆转录病毒载体外，腺相关病毒载体（aav）也越来越受到人们的重视［1］。aav载体主要有3个优点：①无病理作用；②宿主范围广泛，可感染静止期的细胞；③可高效率整合到人类19号染色体的特定位点（19q13,3-qter）。selvarangan等［9］报道的其构建的含人βlcrhs2、β珠蛋白基因启动子和aγ珠蛋白基因的腺相关病毒载体，感染b6(hbbd/hbbd，gpi-ⅰa/gpi-ⅰa)小鼠的骨髓造血干细胞，移植入c57bl/6j(hbbs/hbbs，gpi/-ⅰb/gpi-ⅰb)小鼠体内，人aγ珠蛋白基因在小鼠体内表达达到了小鼠内源性β-actin基因表达水平的4%～6%。最理想的基因治疗方法为用同源重组进行基因置换，但如何提高正确位点的同源重组率，以及在此之后的细胞的筛选和克隆都是尚未解决的难题。当人们看到离直接基因治疗的成功还有相当长的路程时，间接基因治疗又重新受到了重视。2间接基因治疗2.1反义核苷酸技术:有相当一部分的β地贫是由于转录过程中的错误剪切造成的，如ivs-ⅰ-110g→a，ivs-ⅱ-654c→t。反义核苷酸是一段与错误剪切位点互补的多聚寡核苷酸，可封闭前mrna上的错误剪切位点，从而加工出正常的mrna。将编码反义核苷酸的基因序列转入造血干细胞，并使其受到α珠蛋白的调节元件及lcrhs40的控制，使α珠蛋白基因的表达与反义核苷酸的表达相平行。在体外培养的细胞中，反义核苷酸能100%纠正错误剪切。sierakowska［10］等设计的针对ivs-ⅱ-654突变的18bp的2′-o-甲基寡核苷酸与5′错误剪切位点有较高亲和性，正确剪切的βmrna从第6小时后开始出现并持续至46小时，含量达到了βmrna的44%，在试验中，反义核苷酸显示了高度的特异性，对细胞生长也无不良影响。国内亦有应用体外转录和体外剪切系统［11］，以体外转录产生的特异反义rna封闭ivs-ⅱ-654c→t突变基因中3′隐匿剪切位点和5′异常剪切位点，减少异常加工的mrna，使正常mrna水平由25%上升到46%～60%。2.2红细胞生成素(epo)：在临床治疗中，epo能改善镰形细胞贫血以及β地贫患者的症状，促进β和γ珠蛋白基因的表达。但epo达到治疗效果的剂量大、费用昂贵，限制了在临床上的应用。villeval等［12］以改建后的mpzen2逆转录病毒为载体，将猴epo基因转入β地贫小鼠的造血干细胞，明显提高了β地贫小鼠的血细胞比容，β/γ值接近正常。但转epo基因的表达水平难以控制，不是太高，就是太低，以及有可能造成致死性的红细胞增多症，现多将epo与其它药物配伍使用。2.3药物治疗：γ珠蛋白基因在成人后被关闭，若能重新激活γ珠蛋白基因，增加hbf的合成，就能在功能上代偿患者体内β珠蛋白不足的情况。5-氮胞核苷、羟基脲、丁酸盐都曾被用来治疗β地贫，而羟基脲作为一种低毒、有效的α珠蛋白基因的激活剂，在动物试验中被证实确有增加hbf合成的功能，并在长期临床用于镰形细胞贫血的治疗中取得了较好的疗效［13-15］。γ珠蛋白基因的表达水平存在着遗传性差异［16］，benin、bantu和senegal是镰形细胞贫血最常见的3种单倍型。在senegal单倍型中，出现于gγ基因5′端的xmnⅰ识别位点，常导致gγ的高表达和高水平的hbf。lu等［17］检测了βlcrhs2中5′端从8543～9165的约520bp，βlcrhs3从4436～5005约550bp的片段，以及位于β珠蛋白基因上游的(at)x(t)y重复序列、aγt基因上游-222.0到-225.5的4bp的缺失、gγ和aγ珠蛋白基因的启动子序列、gγ基因上游约162bp的框架结构及aγ基因中ivs-ⅱ等这些位点的多态性，在这些顺式作用因子中未发现某种多态与hbf的调控有关，因此认为在γ珠蛋白基因的表达调控中其它顺式作用因子和反式作用因子可能起着更为重要的作用。在hel细胞中，羟基脲诱导参与红细胞成熟分化的因子gata-1和nf-e2的表达［18，19］，并能显著诱导β珠蛋白基因mrna的合成，提示羟基脲可能通过诱导某些转录因子和参与某些信号传递途径促使β珠蛋白基因表达。在羟基脲治疗β地贫患者的临床观察中，患者对羟基脲的反应程度和速度差异非常大，因此认为这种差异性也受遗传因素的影响。以前人们认为在γ珠蛋白基因启动子中的cpg二核苷酸的甲基化导致了基因的关闭［20］，羟基脲通过降低这种甲基化程度导致基因转录的增加，但现在研究表明并不尽然，羟基脲还能纠正某些剪切缺陷［21］，促进正常剪切的βmrna的合成，这说明羟基脲有着更为复杂的影响细胞分化和调控基因表达的机制。患者对羟基脲治疗反应的速度和程度各不相同。olivieri［22］和arruda［23］都有取得了相当好的疗效的报道。steinberg［24］研究了143例羟基脲治疗的镰形细胞贫血患者，发现治疗前粒细胞与网织红细胞计数高的患者对羟基脲的反应较好，hbf升高幅度大。总之羟基脲的作用机制有待进一步研究。3其他能高效转染的、高滴度的，且没有逆转录病毒和aav载体缺点的理想的病毒载体的研制仍然是目前研究的难点，人工染色体的使用则避免了外源基因与宿主基因组的整合，这些都将是以后几年研究的热点。能长期增殖并保持其数量的造血干细胞的分离以及体外扩增，仍有待解决。由于我们无法预期成功的直接基因治疗何时能实现，间接基因治疗和综合治疗在相当长一段时间内仍是当前不可忽视的减轻患者痛苦、延长患者生命的有效手段。作者单位:邹奕杜传书510089广州,中山医科大学医学遗传学教研室参考文献1beuzardy.towardsgenetherapyofhemoglobinopathies.seminhematol,1996,33:43-52.2kasaharan,dozyam,kanyw.tissue-specifictargetingofretroviralvectorsthroughligand-receptorinteractions.science,1994,7266:1373-1376.3hardisonr,slightomjl,gumuciodl,etal.locuscontrolregionsofmammalianbeta-globingeneclusters:combiningphylogeneticanalysesandexperimentalresultstogainfunctionalinsights.gene,1997,205:73-94.4fraserp,pruzinas,antonioum,etal.eachhypersensitivesiteofthehumanbeta-globinlocuscontrolregionconfersadifferentdevelopmentalpatternofexpressionontheglobingenes.genes,1993,7:106-113.5guylg,kothryr,walll.positioneffectsinmicecarryingalacztransgeneinciswiththebeta-globinlcrcanbeexplainedbyagradedmodel.nuclacidsres,1997,25:4400-4407.6waltersmc,fierings,eidemillerj,etal.enhancersincreasetheprobabilitybutnotthelevelofgeneexpression.procnatlacadsciusa,1995,92:7125-7129.7韦官泽，刘德培，陶吉中,等.红系增强子的不同片段对转移的β珠蛋白基因在mel细胞中表达的作用.自然科学进展，1997,7:117-121.8rens,wongby,lij,etal.productionofgeneticallystablehigh-titerretroviralvectorsthatcarryahumangamma-globingeneunderthecontrolofthealpha-globinlocuscontrolregion.blood,1996,87:2518-2524.9ponnazhagans,yodermc,srivastavaa,etal.adeno-associatedvirustype2mediatedtransductionofmurinehematopoieticcellswithlong-termrepopulatingabilityandsustainedexpressionofahumanglobingeneinvivo.jvirol,1997,71:3098-3104.10sierakowskah,sambademj,agrawals,etal.repairofthalassemichumanbeta-globinmrnainmammaliancellsbyantisenseoligonucleotides.procnatlacadsciusa,1996,93:12840-12844.11宫澜，孙琼，任兆瑞,等.反义核酸对β地中海贫血基因(ivs-2-654c→t)剪接缺陷抑制作用的研究.科学通报，1997,42:1884-1887.12villevaljl,rouyer-fessardp,blumenfeldn,etal.retrovirus-mediatedtransferoftheerythropoietingeneinhematopoieticcellsimprovestheerythrocytephenotypeinmurinebeta-thalassemia.b1ood,1994,84:928-933.13ohene-frempongk,smith-whiteyk.useofhydroxyureainchildrenwithsicklecelldisease:whatcomesnextseminhematol,1997,34:30-41.14rogerszr.hydroxyureatherapyfordiversepediatricpopulationswithsicklecelldisease.seminhematol,1997,34:42-47.15scottjp,hilleryca,browner,etal.hydroxyureatherapyinchildrenseverelyaffectedwithsicklecelldisease.jpediatr,1996,128:820-828.16nagelrl,fabryme,pagnierj,etal.hematologicallyandgeneticallydistinctformsofsicklecellanemiainafrica.thesenegaltypeandthebenintype.nengljmed,1985,312:880-884.17luzh,steinbergmh.fetalhemoglobininsicklecellanemia:relationtoregulatorysequencescistothebeta-globingene.multicenterstudyofhydroxyurea.blood,1996,87:1604-1611.18桂长云，蒋椒，钱若兰.羟基脲对人红白血病细胞株中珠蛋白基因表达和细胞分化的影响.实验生物学报，1997,30:375-382.19蒋椒，戴长虹，谢恒月,等.羟基脲对细胞周期与珠蛋白基因表达的影响.实验生物学报，1997,30:109-114.20olivierinf.reactivationoffetalhemoglobininpatientswithbeta-thalassemia.seminhematol,1996,33:24-42.21黄淑帧,顾小锋,fibache,等.羟基脲对βivs-ⅱ-654c→t基因表达的影响，中华血液学杂志,1996,17:395-398.22olivierinf,reesdc,gindergd,etal.treatmentofthalassaemiamajorwithphenylbutyrateandhydroxyurea.lancet,1997,350:491-492.23arrudavr,limacs,saadst,etal.successfuluseofhydroxyureainbeta-thalassemiamajor.nengljmed,1997,336:964.24steinbergmh.determinantsoffetalhemoglobinresponsetohydroxyurea.seminhematol,1997,34:8-14.收稿:1998-09-07修回:1999-02-10（责任编辑：jbwq）
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