急性甲醇中毒大鼠模型及其眼部改变的实验研究http://www.cnophol.com2009-9-3010:23:41中华眼科在线
作者：佘洁婷，张少冲，程建新，冷云霞
【目的】探讨急性甲醇中毒大鼠模型的制作方法及其眼部改变，为研究中毒后视功能损害及救治方法建立基础。【方法】SD大鼠32只，随机分为A（低剂量甲醇组）、B（高剂量甲醇组）、C（生理盐水对照组）、D（空气对照组）四组，每组8只。A、B组吸入N2O/O2混合气及不同剂量甲醇灌胃，C组吸入N2O/O2混合气及生理盐水灌胃，D组置于正常空气中并按B组剂量给予甲醇灌胃，观察各组大鼠一般情况、体质量及眼部改变、静脉血甲醇浓度、视网膜电图和视网膜组织学改变。【结果】染毒大鼠反应迟钝、运动失调，视盘充血水肿、视网膜点状出血，A组大鼠体质量为（187±12）g，B组为（176±13）g，较C、D对照组显著减轻（P<0.05）；A组视网膜电图a、b波振幅分别为（87±13）μV、（187±38）μV，B组a、b波振幅分别为（53±19）μV、（132±39）μV，与对照组相比明显下降（P<0.05）；视网膜在光镜下表现为各层细胞水肿、排列紊乱及空泡化；电镜下细胞凋亡，线粒体肿胀、嵴断裂；B组动物上述改变尤其明显。【结论】吸入N2O/O2混合气及甲醇灌胃可建立急性甲醇中毒的大鼠模型，出现典型的视网膜结构和功能改变。
【关键词】甲醇；急性中毒；大鼠模型；灌胃
Abstract:【Objective】Todeveloparatmodelmanifestingacutemethanolpoisoningandstudytheocularchangessoastolayfoundationsforfurtherinvestigationofvisualimpairmentcausedbymethanolintoxicationanditstreatment.【Methods】Thirty-twoSDratswererandomlydividedintogroupA（lowmethanoldosagegroup,n=8）,B（highmethanoldosagegroup,n=8）,C（salinecontrolgroup,n=8）andD（aircontrolgroup,n=8）.GroupAandBwereexposedtoamixtureofN2O/O2andgivendifferentdosageofmethanolbygavage.GroupCwasexposedtoN2O/O2andgiventhesamevolumeofsalineasgroupB.GroupDwasexposedtonormalairandgiventhesamedosageofmethanolasgroupB.Generalcondition,bodymass,andocularchanges,methanolconcentrationinvenousblood,electroretinogramandretinalhistopathologicchangeswereanalyzed.【Results】Methanol-intoxicatedratswerecharacteristicbyslowreaction,incoordination,opticdischyperemiaandedemaandretinalhaemorrhage.BodymasslosswassignificantingroupAandBwhencomparedwithgroupCandD（P<0.05）,whichwere（187±12）ginAand（176±13）ginB,respectively.A-waveandb-waveofelectroretinogramweremarkedlyreducedingroupAandB（P<0.05）,whichwas（87±13）μVand（187±38）μVingroupA,and（53±19）μVand（132±39）μVingroupB,respectively.Retinaledema,derangementofcellsandprominentvacuoleswereobviousunderlightmicroscope.Morphologicchangesunderelectromicroscopewerecharacteristicbycellapoptosis,mitochondriaswollen,andcristaedisruption.ThesechangesweremoreobviousingroupB.【Conclusion】AcutemethanolpoisoninginratscouldbesuccessfullyduplicatedbyexposuretoamixtureofN2O/O2aswellasmethanoladministrationbygavage,withtypicalretinalstructuralandfunctionalchanges.
甲醇（methanol,CH3OH）是一种无色、有毒的挥发性液体，可经呼吸道、胃肠道和皮肤吸收进入人体而中毒。近年因饮用假酒致急性甲醇中毒的事件时有发生，随着甲醇在人们生产、生活中应用日益广泛，其意外中毒的可能性不断增加。中毒后幸存者常遗留不同程度的视觉损害，而目前甲醇致视功能损害的机理尚未明确，国内仅见临床病例报道[1]，缺乏相关的实验研究。国外研究采用的大鼠种属在我国并不普及，在建模方法、染毒剂量、评价指标等方面缺乏系统性及可比性[2,3]。本研究采用SD大鼠，设立不同剂量甲醇灌胃组，借鉴人类急性甲醇中毒的诊断标准制订该模型的评价指标，探讨其眼部结构和功能改变，较系统地建立了急性甲醇中毒的大鼠模型，为今后进一步研究视功能损害机理及救治方法打下基础。
1材料和方法
1.1主要试剂与仪器
分析纯甲醇（广州化学试剂厂），以生理盐水稀释成质量浓度为30％的甲醇溶液；40L压缩N2O∶O2混合气体（1∶1，广州气体厂）；4％多聚甲醛、苏木素、伊红（中山眼科中心病理室提供）；2.5％戊二醛、1％四氧化锇（中山大学医学院电镜室提供）；枸橼酸钠抗凝管、生理盐水；NEUROPAKⅡ电生理检查仪（日本光电公司），Stemi2000-C显微镜（德国ZEISS），H-600透射电镜（日本HITACHI）。
1.2实验动物分组及模型建立
健康SPF级雄性SD大鼠32只（广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005A010），体质量200~220g，用随机数排序分组法分为4组，每组8只。A组：低剂量甲醇组；B组：高剂量甲醇组；C组：生理盐水对照组；D组：空气对照组。从灌胃前4h起至实验结束，A、B、C组大鼠均置于一密闭有机玻璃箱中，以2L/min的速度通入N2O∶O2混合气体，D组大鼠置于正常空气中。开始通气时间定为0h，分别在第4，24，48h给各组大鼠灌胃，A组：首次甲醇溶液灌胃剂量为2g/kg，其后每次1g/kg；B组：首次灌胃剂量4g/kg，其后每次2g/kg；C组：与B组等体积的生理盐水代替甲醇灌胃；D组：按B组剂量给予甲醇溶液灌胃。第60小时停止通气，作各项指标检测。
1.3模型的评价指标及方法
1.3.1全身及眼部的中毒表现观察甲醇灌胃后大鼠的反应、活动、意识状态、体质量变化；裂隙灯观察结膜、角膜、前房、晶状体改变；直接眼底镜观察视网膜血管、视盘等的改变。
1.3.2视网膜电图检测于第60天取出大鼠暗适应4h，复方托品酰胺散瞳，氯胺酮50mg/kg、氯丙嗪25mg/kg混合腹腔注射，丁卡因表麻，NeuropackⅡ电生理仪检测视网膜电图（Electroretinogram,ERG），记录I16单次白光刺激下a波、b波潜伏期及振幅。所有操作均在有微弱红光照明的暗室内进行，未检查眼用不透光黑布遮盖避光，角膜电极、参考电极和地电极分别置于角膜表面、舌下和尾部。
1.3.3静脉血甲醇浓度的检测ERG检查结束后，剪开大鼠胸腔，从右心房抽取静脉血2mL注入干燥真空的枸橼酸钠抗凝管中充分振荡，采用顶空气相色谱法检测血中甲醇浓度。
1.3.4视网膜组织学检查采血后以断颈法处死大鼠，迅速摘除双眼球，解剖显微镜下去除眼前节，分离视网膜，固定于4％多聚甲醛中48h，按常规制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察。
1.3.5视网膜超微结构检查按上述方法分离视网膜，剪出1mm×5mm大小视网膜组织，PBS漂洗，固定于2.5％戊二醛4℃冰箱过夜，次日1％四氧化锇后固定2h，丙酮系列脱水，Epon812定向包埋制成超薄切片，醋酸双氧铀γ柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察。
1.4统计学分析
实验数据以均数±标准差表示，采用SAS10.0统计软件的one-wayANOVA及SNK-q检验对各组间差异进行分析，以α＝0.05作为检验水准。
2.1中毒表现
A组大鼠毛色差，活动减少，消瘦；B组中1只大鼠于第2次灌胃后5h死亡，其余动物毛色灰暗，反应呆滞，明显消瘦，运动失调，结膜及鼻孔出血。裂隙灯下各组动物角膜、前房、虹膜、晶状体未见特殊改变；直接眼底镜下A组动物出现视网膜血管轻度迂曲及点状出血，B组动物视盘边界不清，表面充血，视网膜灰白混浊，有点、片状出血，血管迂曲变细。C、D组动物毛色光滑，反应如常，眼底无异常改变。实验结束时，C、D组体质量无显著性差异；与对照组比较，A、B组体质量下降，差异有统计学意义（F=30.84，P<0.0001，表1）。
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