进行性脊髓性肌萎缩症的基因诊断研究
中华神经科杂志1998年第6期第31卷论著
作者：李宁 沈定国
单位：100853北京,中国人民解放军总医院肌病研究室
关键词：肌萎缩；脊髓性；诊断；基因；
【摘要】 目的 建立进行性脊髓性肌萎缩症（SMA）的特异性基因诊断方法。方法 采用不对称聚合酶链反应（PCR）方法扩增运动神经元生存（SMN）基因，并结合单链构象多态性（SSCP）分析方法分析该基因的变异和缺失。结果 37例SMA患者中SMN基因外显子7缺失者占92%（34/37），外显子8缺失者占89%（33/37），3%（1/37）的患者外显子7缺失而保留外显子8；患者家属及正常对照SMN基因均未见缺失（0/40）。结论 建立的PCR-SSCP分析方法特异性及敏感性很高，可以用来对SMA患者进行基因诊断。
developmentofgeneticdiagnosticassayonspinalmuscularatrophy LiNing,ShenDingguo.DivisionofNeuromuscularDisordersResearch,TheGeneralHospitalofChinesepLA,Beijing100853
【Abstract】 Objective Todevelopageneticdiagnosisassaytodetectspinalmuscularatrophy（SMA）patients.Methods Usingtheasymmetricalpolymerasechainreaction（PCR）andsinglestrandconformationpolymorphism（SSCP）assays,wedevelopedageneticdiagnosticassaytodetectthedeletionofsurvivalmotorneuron（SMN）geneintheChineseSMApatients.Results Atotalof37SMApatientsand20casesofthenormalcontrolsand20casesoftheSMApatients'parentswereanalyzed.Theexons7and8ofSMNgenewerefoundtobedeletedin92%（34/37）and89%（33/37）patientsrespectively.3%（1/37）SMApatientslackedtheexon7butretainedexon8.Nodeletionwasfoundinthecontrols（0/40）.Conclusions Theresultsindicatedthattheassaysutilizedwerehighlysensitiveandspecific，andthePCR-SSCPanalyticmethodsestablishedcouldbeofusetodetectthedeletionofSMNgenesforthegeneticdiagnosisofSMA.
【Keywords】 Muscularatrophy,spinal Diagnosis,gene
儿童型进行性脊髓性肌萎缩症（SMA）是儿童最常见的致死性常染色体隐性遗传病之一，发病率约为1/8000活产婴儿。病理改变为脊髓前角运动神经元的变性、缺失。临床表现为进行性、对称性肌肉萎缩及无力。根据临床起病的早晚及疾病的进展情况可分为3型。其发病机制及致病基因一直未能明确。1990年，Brzustowicz等［1，2］明确了3型SMA具有基因同源性，均位于染色体5q11.2～13.3。此后几年陆续发现了许多与SMA基因紧密连锁的多态位点［3，4］，基于这些基因多态位点检测及连锁分析的基因诊断和产前诊断方法操作复杂，并由于大量基因重复序列和基因重排的存在，误诊的机率很高［5］。直至1995年，Lefebvre等［6］发现了运动神经元生存（SMN）基因，位于染色体5q13.1区，与SMA有极高的相关性，成为当时遗传性疾病分子生物学研究最引人瞩目的成就之一。随后,如何利用SMN基因进行基因诊断及产前诊断成为国际上研究的新热点。我们于1996年5月建立了检测SMN基因的不对称聚合酶链反应（PCR）及单链构象多态性（SSCP）分析方法，分析了中国人SMA患者、患者父母及正常人SMN基因变异及突变情况。
一、临床资料
患者37例，20名患者家属及20名正常人作对照。SMA患者中Ⅰ型8例，Ⅱ型15例，Ⅲ型14例。初诊年龄7个月至23岁；临床主要表现为四肢力弱、肌张力低、肌萎缩、腱反射消失；肌电图主要表现为运动单位电位时限延长，重收缩时运动单位电位数量减少，神经传导速度正常；肌肉组织化学检查主要表现为小组及大组型肌萎缩，未见明显变性坏死；血清肌酸激酶正常。所有患者均根据1992年欧洲神经肌病研究中心主持的SMA国际研讨会诊断及分型标准［7］，经肌电图及肌肉活检确诊。其分型标准为Ⅰ型：又称恶性型、Werdnig-Hoffmann病，为出生后软婴儿，不能独坐，多在2岁前死亡。Ⅱ型：又称中间型，出生后6～18个月间出现四肢疲软，以下肢为重，可独坐，但不能独自站立及行走，存活2年以上。Ⅲ型：又称轻型、Kugelberg-Welander病，于出生18个月后至青少年期出现肢体近端的对称性力弱，良性进展，病程中保留行走能力，能存活至成年。
二、方法
1.DNA提取：取外周血5ml，经EDTA抗凝，用常规方法分离外周血白细胞，经蛋白酶K消化后用饱和酚法提取DNA，全部方法参照《分子克隆实验指南》［8］一书。
2.不对称PCR：不对称PCR扩增SMN基因外显子7和8的单链DNA，扩增引物分别为R111（+）（5′-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3′），541C770（-）（5′-TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC-3′）和541C960（+）5′-GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3′，541C1120（-）（5′-CTACAACACCCTTCTCACAG3′）［6］。两条引物在反应体系内的比例为30∶1。在总共30μl的反应体系中加入Taq酶1U、10×PCR反应缓冲液3μl、2mmol/μldNTPs1.5μl。PCR反应条件94℃45秒、56℃45秒及72℃1分钟，共55个循环。
3.PCR产物的SSCP分析及银染显色:用不对称PCR方法扩增所得单链DNA可直接用于SSCP分析。取5μl扩增产物与5μl载样缓冲液（95%甲酰胺，20mmol/LEDTA，0.5g/L溴酚蓝，0.5g/L二甲苯蓝）混匀，上样至12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是0.5×TBE缓冲液，电流10mA，4～5小时。凝胶浓度为10%，并加入5%的甘油以增加结果的分辨率。凝胶经银染（silverstaining）显色，具体步骤：10%乙酸固定凝胶30分钟，去离子水清洗；1g/L硝酸银与0.5g/L甲醛染色30分钟，去离子水洗2次；0.3g/LNa2CO3、0.5g/L甲醛、2mg/LNa2S2O3、5H2O显色2～5分钟。
经不对称PCR扩增及SSCP分析发现，37例SMA患者中SMN基因外显子7缺失者占92%（34/37）；外显子8缺失者占89%（33/37）；只有1例Ⅱ型患者外显子7缺失而保留外显子8，占3%（1/37）（附图）。其中重型（Ⅰ型）患者的外显子7和8的缺失率均为100%（8/8），轻型（Ⅱ型和Ⅲ型）患者外显子7和8的缺失率分别为90%（26/29）和86%（25/29）。37例患者的着丝粒端基因拷贝未见缺失（0/37）。20名患者家属及20名正常对照SMN基因及着丝粒端拷贝外显子7和8均无缺失（0/40）。我们建立的PCR-SSCP分析方法与临床诊断的符合率为96%（74/77）。
1：正常对照；2：着丝粒端基因拷贝质粒，不含SMN基因；3：II型患者，SMN外显子7缺失，外显子8不缺失；4～7：SMA患者，SMN外显子7和8均缺失；8：SMA患者，外显子7及8均未见缺失
附图 SMN基因外显子7和8的单链构象多态性分析结果
SMA是常见的致死性常染色体隐性遗传病之一，长期以来,由于没有有效的治疗方法，给社会及家庭带来了沉重的负担，因此，防止患儿出生是防止该病的关键。以往,由于与SMA连锁的多态位点的检测及家系的连锁分析的基因诊断方法操作复杂，误诊的机率高。1995年法国Necker研究所的Lefebvre等［6］新发现的SMN基因与SMA有很高的相关性，93.0%（213/229）的SMA患者该基因外显子7和8缺失或截断，另有5.7%（13/229）的患者外显子7缺失而保留外显子8，余下1.3%（3/229）的患者表现为SMN基因内含子缺失或点突变；而正常对照（246名）和SMA患者的父母（127名）未见1例缺失，提示SMN基因可能是SMA的致病基因。随后，国外许多研究机构均对SMA患者进行了SMN基因的检测，基因缺失率为90%～98%［9，10］，少部分患者外显子7缺失而外显子8保留，尚无单纯外显子8缺失的报道。我们对中国人SMN基因的突变情况进行了分析，本组资料显示中国人SMA患者SMN基因外显子7和8的缺失率分别为92%（34/37）和89%（33/37），其中3%（1/37）的外显子7缺失而保留外显子8，而对照组无一例缺失（0/40），与国外报道的结果一致。提示SMA患者SMN基因突变率很高，与SMA患者有很高的相关性，据此可通过检测SMN基因,对SMA患者进行基因诊断及产前诊断。外显子7与8的共缺失率高达97%（33/34），尤其是所有基因缺失患者均有外显子7的缺失，因此对于SMA患者的临床检测也可单纯检测外显子7。由于SMN基因缺失率高达90%以上，且没有假阳性，利用SMN基因进行基因诊断的敏感性及特异性均高，且较连锁分析更加简便准确，因而在产前诊断中有着尤为重要的应用价值。
自从Orita等［11］1989年首先建立SSCP分析方法以来，因其敏感和特异而被广泛用于核酸变异的检测和分析，其基本原理是单链核酸于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率与核酸的一级结构和构象密切相关，核酸序列的变异，甚至单碱基突变，都可能改变该基因片段的构象，从而改变其电泳迁移速率。我们用于SMA基因诊断的SMN基因位于染色体5q13.1区，在该染色体着丝粒端的重复序列中存在SMN基因的拷贝，但两个拷贝间存在5个碱基的差异，因此可利用它们单链核酸构象的不同，通过SSCP分析将2个拷贝区分开来，从而发现SMN基因的缺失。国外运用SSCP分析检测SMN基因过程中采用的是双链PCR产物经热变性成单链DNA，经聚丙烯凝胶电泳后放射自显影的方法检测SMN基因。考虑到同位素对人体的损伤和不便于管理，我们改用硝酸银染色方法，该方法简便，易于操作，不需要特殊检测仪器。但采用银染法需加大上样量，而高浓度变性的单链易复性成双链，影响电泳分辨效果。因此,我们采用了不对称PCR方法直接扩增单链PCR产物，这样就克服了单链DNA复性的问题，也解决了放射线污染的问题，且操作更为简便、直观，临床易于推广。
1 BrzustowiczLM,LehnerT,CastillaLH,etal.Geneticmappingofchronicchildhood-onsetspinalmuscularatrophytochromosome5q11.2-13.3.Nature,1990,344:540-541.
2 GilliamTC,BrzustowiczLM,CastillaLH,etal.Genetichomogenetitybetweenacuteandchronicformsofspinalmuscularatrophy.Nature,1990,345:823-825.
3 ShethP,AbdelhakS,BachelotMF,etal.Linkageanalysisinspinalmuscularatrophy,bysixcloselyflankingmarkersonchromsome5.AmJHumGenet,1991,48:764-768.
4 WangCH,KleynPW,VitaleE,etal.Refinementofthespinalmuscularatrophylocusbygeneticandphysicalmapping.AmJHumGenet,1995,56:202-209.
5 MelkiJ,LefebvreL,BurglenL,etal.Denovoandinheriteddeletionsofthe5q13regioninspinalmuscularatrophies.Science,1994,264:1474-1477.
6 LefebvreS,BurglenL,ReboulletS,etal.Identificationandcharacterizationofaspinalmuscularatrophydetermininggene.Cell,1995,80:155-165.
7 MunsatTL,DaviesKE.InternationalSMAConsortiumMeeting.NeuromusculDisord,1992,2:423-428.
8 SambrookJ,FritschEF,eds.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，译.第2版.北京：科学出版社，1992.464-467.
9 CaponF,LevatoC,SempriniS,etal.DeletionanalysisofSMNandNAIPgenesinspinalmuscularatrophyinItalianfamilies.MuscleNerve,1996,19:378-380.
10 RodriguesNR,CampbellL,OwenN,etal.Prenataldiagnosisofspinalmuscularatrophybygenedeletionanalysis.Lancet,1995,345:1049.
11 OritaM,SuzukiY,SekiyaT,etal.RapidandsensitivedetectionofpointmutationsandDNApolymorphismsusingthepolymerasechainreaction.Genomics,1989,5:874-879.
（收稿：1998-04-03 修回：1998-06-10）
