付蓉 邵宗鸿 和虹 刘鸿 贾海蓉 孙娟 赵明峰何广胜 施均 白洁 储榆林 杨天楹
【摘要】 目的 探讨Ｂ淋巴细胞在免疫相关性全血细胞减少症（ＩＲＰ）发病中的作用。方法 采用流式细胞术测定25例初诊患者，15例治疗后血常规恢复正常的患者和10名正常人骨髓总Ｂ淋巴细胞、ＣＤ5+Ｂ淋巴细胞的数量以及Ｂ淋巴细胞膜表面凋亡相关蛋白Ｆａｓ抗原（ＣＤ95）、胞浆内抗凋亡蛋白ｂｃｌ2的表达。结果 ＩＲＰ初诊患者总Ｂ淋巴细胞、ＣＤ5+Ｂ淋巴细胞比例显著高于治疗后血常规恢复组和正常人（Ｐ均<0.05），后两组相比，差异无显著性（Ｐ>0.05）；三组Ｂ淋巴细胞Ｆａｓ抗原的表达率差异无显著性（Ｐ均>0.05）；初诊患者Ｂ淋巴细胞胞浆内ｂｃｌ2的表达率显著高于其它两组（Ｐ均<005），治疗后血常规恢复组也显著高于正常对照组（Ｐ<0.01）；各组间Ｂ淋巴细胞凋亡相关指数（ＣＤ19+ＣＤ95+/ＣＤ19+ｂｃｌ2+）比较，初诊组显著低于治疗后血常规恢复组和对照组（Ｐ均<0.01），治疗后血常规恢复组也显著低于对照组（Ｐ<0.05）；Ｂ淋巴细胞的比例与治疗起效时间呈正相关（ｒ=0.69，Ｐ<001）。结论 ＩＲＰ患者自身抗体的产生可能与Ｂ淋巴细胞及其亚群数量异常、凋亡受抑有关。
【关键词】 全血细胞减少； 免疫性疾病； Ｂ淋巴细胞； 细胞凋亡
我们曾经报道过一组与异常免疫（自身抗体）相关的全血细胞减少症，称之为“免疫相关性全血细胞减少症（ＩＲＰ）”[1]。为进一步探讨ＩＲＰ的发病机制，我们对该病患者骨髓Ｂ淋巴细胞及其亚群的数量和部分凋亡相关蛋白进行了检测，结果报告如下。
病例和方法
1 病例 ＩＲＰ患者40例，其中初诊患者25例，男10例，女15例，年龄11～50岁，中位年龄30岁；治疗后血常规恢复正常患者15例，男4例，女11例，年龄18～50岁，中位年龄36岁。所有患者均系中国医学科学院血液病医院血一科住院患者，并按下述标准确诊：①两系或全血细胞减少，网织红细胞和中性粒细胞比例不低；②骨髓中红系细胞比例正常或偏高，易见红系细胞“造血岛”；③排除已知的各种原发、继发血液系统疾病；④骨髓单个核细胞（ＢＭＭＮＣ）Ｃｏｏｍｂｓ试验（+）。对照组骨髓标本10份，男4份，女6份，年龄15～50岁，中位年龄33岁。取自非血液系统疾病和非自身免疫性疾病患者开胸手术后的肋骨，形态学检查均呈正常骨髓象。
2 试剂与仪器 藻红蛋白（ＰＥ）标记的鼠抗人ＣＤ5、Ｆａｓ（ＣＤ95）、ｂｃｌ2，异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的鼠抗人ＣＤ19及它们各自的同型对照。流式细胞术红细胞裂解液（0.155ｍｏｌ/ＬＮＨ4Ｃｌ、0.01ｍｏｌ/ＬＫＨＣＯ3、010ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ）购自美国ＢＤ公司。皂素购自美国Ｓｉｇｍａ公司。流式细胞仪ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅ为ＢＤ公司产品。
3 实验方法
3.1 ＣＤ5+及ＣＤ95+Ｂ淋巴细胞比例的测定：在两个检测管中分别加入ＣＤ19ＦＩＴＣ标记的鼠抗人特异性单抗20μｌ，再分别加入ＣＤ5ＰＥ、ＣＤ95ＰＥ标记的鼠抗人特异性单抗各20μｌ。取新鲜肝素抗凝骨髓液150μｌ加入上述两个检测管中。混匀，4℃避光孵育40ｍｉｎ，加入2ｍｌ红细胞裂解液，混匀，室温孵育10ｍｉｎ，ＰＢＳ液洗2遍，最后加入200μｌ10ｇ/Ｌ的多聚甲醛固定液，混匀，4℃固定30ｍｉｎ。同型对照管加入鼠抗人ＩｇＧ1ＦＩＴＣ和ＩｇＧ2ＰＥ各20μｌ，按上述同法操作。最后用流式细胞仪分别测定ＣＤ19+细胞ＣＤ5及ＣＤ95的表达率。每个样品收集15000个细胞。
3.2 Ｂ淋巴细胞胞浆内ｂｃｌ2表达率的测定：参照文献[2]方法。取肝素抗凝骨髓标本用淋巴细胞分离液分离ＢＭＭＮＣ，计数，用ＰＢＳ调整细胞浓度为2×106/ｍｌ。实验管中加入ＣＤ19ＦＩＴＣ，对照管中加入同型不相关单抗ＩｇＧ1ＦＩＴＣ各20μｌ，再分别加入ＢＭＭＮＣ悬液各100μｌ，4℃孵育30ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗涤2遍，再用1ｍｌ10ｇ/Ｌ的多聚甲醛4℃固定15ｍｉｎ。各加1ｍｌ含1ｇ/Ｌ皂素ＰＢＳ室温孵育60ｍｉｎ，ＰＢＳ洗2遍。实验管中加入ＰＥｂｃｌ2单抗，对照管中加入同型不相关ＩｇＧ2ＰＥ单抗各20μｌ，4℃孵育45ｍｉｎ，ＰＢＳ洗3遍。加入200μｌ10ｇ/Ｌ多聚甲醛4℃固定30ｍｉｎ，最后用流式细胞仪测定ＣＤ19+细胞胞浆内ｂｃｌ2的表达率，每个样品收集15000个细胞。
4 治疗方法 所有患者均接受肾上腺糖皮质激素治疗（口服泼尼松，剂量为0.5ｍｇｋｇ-1ｄ-1），部分患者因病情需要加用大剂量静脉丙种球蛋白（剂量为0.4ｇｋｇ-1ｄ-1×5ｄ）和环孢菌素Ａ（ＣｓＡ）（剂量为3ｍｇｋｇ-1ｄ-1）。
5 数据统计 采用ｔ检验和相关与回归分析，应用ＳＰＳＳ8.0数据统计软件分析实验结果。
结果
1 骨髓总Ｂ淋巴细胞（ＣＤ19+细胞）占ＢＭＭＮＣ的比例 初治组Ｂ淋巴细胞占ＢＭＭＮＣ的（8.4±46）%，治疗后血常规完全恢复组为（3.0±1.5）%，对照组为（3.0±1.4）%。初治组明显高于治疗后血常规恢复组和对照组，差异有显著性（Ｐ均<0.01）。治疗后血常规恢复组与对照组比较，差异无显著性（Ｐ>0.05）。提示Ｂ淋巴细胞多寡与ＩＲＰ病情相关。
2 骨髓ＣＤ5+Ｂ淋巴细胞占总Ｂ淋巴细胞的比例 以ＣＤ19+ＣＤ5+细胞占ＣＤ19+细胞的百分率来表示ＣＤ5+Ｂ淋巴细胞的比例，初治组为（21.2±11.6）%，治疗后血常规恢复组为（12.3±10.4）%，对照组为（12.0±5.9）%，初治组明显高于治疗后血常规恢复组和对照组，差异有显著性（Ｐ均<0.05）。治疗后血常规恢复组与对照组比较，差异无显著性（Ｐ>005）。提示ＩＲＰ患者Ｂ淋巴细胞亚群失衡。
3 Ｂ淋巴细胞膜表面Ｆａｓ抗原（ＣＤ95）的表达 以ＣＤ19+ＣＤ95+细胞占ＣＤ19+细胞的百分率来对骨髓Ｂ淋巴细胞Ｆａｓ抗原的表达进行分析，初治组为（210±10.5）%，治疗后血常规恢复组为（20.6±9.1）%，对照组为（14.9±8.0）%，各组之间比较，差异均无显著性（Ｐ均>0.05）。
4 骨髓Ｂ淋巴细胞胞浆内ｂｃｌ2蛋白的表达 以ＣＤ19+ｂｃｌ2+细胞占ＣＤ19+细胞的百分率来对骨髓Ｂ淋巴细胞ｂｃｌ2蛋白的表达进行分析，初治组为（800±17.6）%，治疗后血常规恢复组为（40.1±230）%，对照组为（18.1±9.2）%。初治组明显高于其它两组，差异有显著性（Ｐ均<0.01）。治疗后血常规恢复组也明显高于对照组，差异有显著性（Ｐ<0.01）。提示ＩＲＰ患者Ｂ淋巴细胞凋亡受抑。
5 ＣＤ19+ＣＤ95+/ＣＤ19+ｂｃｌ2+（Ｂ淋巴细胞凋亡相关指数） 初治组为0.299±1.545，治疗后血常规恢复组为0.757±0.465，对照组为2.099±1.780，初治组显著低于治疗后血常规恢复组和对照组（Ｐ值均<0.01），治疗后血常规恢复组显著也低于对照组（Ｐ<0.05）。再次提示Ｂ淋巴细胞凋亡受抑。
6 骨髓Ｂ淋巴细胞比例与临床疗效的相关性 以治疗后患者血红蛋白水平升高20ｇ/Ｌ所需的时间作为起效时间。将初治组的25例患者的Ｂ淋巴细胞比例与该组患者治疗后的起效时间进行相关分析，结果显示二者呈显著正相关（ｒ=0.69，Ｐ<0.01）。（见图1）。说明Ｂ淋巴细胞量愈多，免疫抑制治疗起效愈慢。图1 ＩＲＰ患者骨髓Ｂ淋巴（ＣＤ19+）细胞量与治疗起效时间的相关性
讨论
ＩＲＰ是我们近年从“全血细胞减少症”中分离出的一种独立的疾病实体。深入研究其发病机制，不仅有利于制定更有效的治疗策略，而且有助于在临床上与其它“全血细胞减少症”鉴别。ＩＲＰ患者血细胞减少的可能机制是机体产生了针对骨髓造血细胞的自身抗体，这种自身抗体结合在ＢＭＭＮＣ的细胞膜上，而引起骨髓造血细胞的破坏，和（或）功能受抑，最终引起全血（或一系、二系）细胞减少。
为了证实该假设，我们对可能产生自身抗体的Ｂ淋巴细胞极其亚群的数量进行了检测，结果表明，ＩＲＰ患者不仅Ｂ淋巴细胞比例超过正常，而且亚群失衡，特别是ＣＤ5+Ｂ淋巴细胞明显多于正常人，且与ＩＲＰ病情相关。结合已有学者发现ＣＤ5+Ｂ淋巴细胞在其它的抗体介导的自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、Ⅰ型糖尿病、重症肌无力、毒性弥漫性甲状腺肿）患者体内数量显著增多[310]，相信ＩＲＰ患者体内抗ＢＭＭＮＣ自身抗体的产生与Ｂ淋巴细胞数量及其亚群数量异常有直接关系。
ＩＲＰ患者Ｂ淋巴细胞数量增多是否与凋亡异常有关？为此我们进一步观察了两个凋亡相关蛋白在ＩＲＰ患者骨髓Ｂ淋巴细胞中的表达。我们研究发现，初诊、治疗后血常规恢复正常的ＩＲＰ患者和正常人骨髓Ｂ淋巴细胞膜表面Ｆａｓ蛋白的表达率在三组之间无差异，这提示ＩＲＰ患者骨髓Ｂ淋巴细胞本身不存在Ｆａｓ/ＦａｓＬ系统的异常。但是，Ｂ淋巴细胞胞浆内ｂｃｌ2的表达率在三组之间有显著性差异，初诊组显著高于其它两组，即使经过有效治疗血常规完全恢复正常的患者仍有较高水平的ｂｃｌ2表达。因此，我们认为ＩＲＰ患者骨髓Ｂ淋巴细胞存在着抗凋亡因素ｂｃｌ2的高表达，这可能是细胞得以“累积”、进而“不断”产生自身抗体的一种机制。
总之，ＩＲＰ患者骨髓Ｂ淋巴细胞数量及亚型明显异常、Ｂ淋巴细胞抗凋亡蛋白过度表达。这与我们以往对ＩＲＰＢＭＭＮＣ自身抗体的发现和泼尼松、大剂量丙种球蛋白治疗ＩＲＰ获得较好疗效相吻合。当然，要明确ＩＲＰ的发病机制还须做很多工作。
参考文献
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