血管紧张素转换酶基因多态性与2型糖尿病患者脑梗塞的关系
中华内分泌代谢杂志1999年第3期第15卷论著
作者：段文澜 方京冲 杨海春 朱蔚珏 谢洁怡 杨秀芳 俞茂华 朱禧星
单位：段文澜 方京冲 谢洁怡 杨秀芳 俞茂华 朱禧星 200040 上海医科大学附属华山医院糖尿病研究室；杨海春 朱蔚珏 肾病实验室
关键词：脑梗塞；糖尿病，2型；血管紧张素转换酶；基因多态性
【摘要】 目的 探讨血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性与2型糖尿病脑梗塞间的关系。方法 应用多聚酶链反应（PCR）技术，对109名2型糖尿病患者及52名正常对照者的ACE基因插入/缺失（I/D）型多态性进行检测，并用Logistic多元逐步回归，筛选出2型糖尿病患者脑梗塞的高危因素。结果 （1）糖尿病总组ACE 基因型频率和等位基因频率与正常对照组无 显著性差异（P＞0.05）。（2）糖尿病脑梗塞组ACE基因DD型和D等位基因频率显著高于非脑梗塞组（P＜0.01）及正常对照组（P＜0.05）。（3）多元逐步回归分析显示：ACE基因DD型、D等位基因、脂蛋白（a）及年龄是糖尿病脑梗塞的独立危险因素，而ACE基因II型和I等位基因则为2型糖尿病脑梗塞的保护因子。结论 ACE基因I/D多态性与2型糖尿病脑梗塞的发病密切相关。ACE基因I/D多态性检测对糖尿病脑梗塞的一级预防有一定的指导意义。
Associationbetweenangiotensin-convertingenzymegenepolymorphismandcerebralinfarctionintype2diabeticpatients
DUANWenlan,FANGJingchong,YANGHaichun,etal.
DiabetesResearchDepartment,HuashanHospital,ShanghaiMedicalUniversity,Shanghai,200040
【Abstract】 Objective Toinvestigatetheassociationbetweenangiotensin-convertingenzyme（ACE）geneinsertion/deletion（I/D）polymorphismandcerebralinfarctionintype2diabeticpatients.Methods ACEgeneI/Dpolymorphismwithinintron16wasdeterminedbypolymerasechainreaction（PCR）in109type2diabeticpatientsand52normalcontrols.Variables,includingbloodpressure,HbA1c,FMN,serumlipidprofile,apoproteins,lipoprotein（a）,serumC-peptideandACEgeneI/Dpolymorphism,wereanalyzedbymultivariatestepwiselogisticregressiontodeterminetheindependentandsignificantriskfactorsforcerebralinfarctionintype2diabeticpatients.Results （1）NosignificantdifferenceingenotypeandallelefrequencyofACEgenewasobservedbetweentype2diabeticpatientsandcontrolgroup.（2）TheDDgenotypeandDalleleweremorecommonindiabeticpatientswithcerebralinfarction（0.43and0.60）thaninthosewithoutcerebralinfarction（0.13and0.37,P＜0.01）andcontrolgroup（0.17and0.39,P＜0.05）.（3）MultivariatestepwiseregressionanalysisshowedthatDDgenotype,Dallele,lipoprotein（a）,andagecontributedsignificantlytocerebralinfarctionintype2diabeticpatients.Theoddsratios（95%CI）were7.69（2.35～25.19）,P=0.001;5.47（1.39～21.56）,P=0.015;1.12（1.03～1.22）,P=0.011and1.09（1.03～1.16）,P=0.004,respectively.However,IIgenotypeandIallelewereshowntobeprotectivefactorsforcerebralinfarctionintype2diabeticpatients,theoddsratios（95%CI）were0.28（0.13～0.60）,P=0.001and0.21（0.05～0.79）,P=0.022,respectively.Conclusion DDgenotypeandDalleleofACEgenewereindependentriskfactorsforcerebralinfarctionintype2diabeticpatients.ACEgeneI/DpolymorphismanalysisbyPCRisconducivetoearlydetectionofdiabeticpatientssusceptibletocerebralinfarction.
【Keywords】 Cerebralinfarction Diabetesmellitus,type2 Angiotensin-convertingenzyme Genepolymorphism
（ChinJEndocrinolMetab,1999,15:156-159）
糖尿病患者脑血管疾病的发病率为非糖尿病人群的2～4倍〔1〕，其发病后的复发率、致残率和死亡率明显升高〔2〕。了解糖尿病脑血管并发症的危险因素已成为糖尿病防治工作的重要内容。ACE基因多态性与2型糖尿病患者冠心病发病有关，这已被人们公认〔3，4〕。最近国外不少研究〔5-7〕提示ACE基因I/D多态性与脑血管疾病的发病和预后有关。糖尿病脑血管疾病以脑梗塞为最多见。2型糖尿病患者脑梗塞是否也与ACE基因多态性有关，目前尚无定论。本研究通过对2型糖尿病患者ACE基因I/D多态性的研究，了解我国2型糖尿病患者中ACE基因I/D多态性与脑梗塞的关系，以更好地指导糖尿病脑血管疾病的一级预防工作。
对象和方法
一、对象
1.正常对照组：52例，男30例，女22例，年龄（54.5±12.6）岁（20～63岁），均为本院健康职工及住院患者，无糖尿病、高血压、冠心病、脑梗塞及肾病病史。
2.2型糖尿病组：109例，男57例，女52例，年龄（62.3±10.4）岁（40～83岁），为本院门诊及住院的2型糖尿病患者（1997.6～1998.3）。糖尿病诊断按1985年WHO标准。脑梗塞诊断依据头颅MRI确诊。本组患者分脑梗塞组及非脑梗塞组，按MRI表现，脑梗塞组进一步分为腔隙性脑梗塞和非腔隙性脑梗塞。本组患者均接受降糖、降压及降脂治疗。以口服降糖药和（或）基因重组人胰岛素控制血糖，其中，口服降糖药治疗采用磺酰脲类、双胍类及α-葡萄糖苷酶抑制剂单药或联合治疗；以血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）开搏通、洛汀新等及钙离子拮抗剂（CCBI）心痛定、络活喜等控制血压；以HMG-CoA还原酶抑制剂舒降之或纤维酸衍生物吉非罗齐、力平脂控制血脂。
二、方法
1.糖化血红蛋白（HbA1c）采用免疫凝集抑制法（DCA2000仪，Bayer公司），果糖胺（FMN）采用NBT一次法，C肽（C-P）采用放免法，血脂和脂蛋白（T-Ch,TG,HDL-C,LDL-C）采用脂酶法，载脂蛋白（ApoA1,B100）采用比浊法，脂蛋白（a）〔Lp（a）〕采用ELISA法。
2.ACE基因分析：（1）取新鲜血2ml，采用中科院赛尔公司ACE基因PCR试剂盒，逐步进行白细胞DNA的抽提、PCR扩增。扩增的目的基因片段为ACE基因内含子16的一个287bp的Alu顺序多态标志。PCR引物顺序为：正引物：5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3'，负引物：5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’。用JK-2型PCR扩增仪（上海医科大学生物物理教研室）进行扩增。初期变性为96℃，6分钟，继之进行30个循环，每个循环变性94℃，1分钟；退火56℃，1分钟；延伸72℃，1.5分钟。（2）PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，以上述药盒提供的标准样品扩增产物为对照，溴乙锭染色观察结果。（3）扩增产物的分析：如电泳仅见490bp片断，ACE基因为II型；如仅见190bp片断，ACE基因为DD型；如见490bp和190bp二个片断，则ACE基因为DI型。
三、统计学处理
各ACE基因型频率和等位基因频率均经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。组间差异采用t检验及χ2检验，P＜0.05具统计学意义。Logistic多元逐步回归采用美国STATA统计软件进行。数值
一、2型糖尿病患者的一般情况
除脑梗塞组的年龄和病程显著大于非脑梗塞组外，其它各项无显著性差异，见表1。
表1 2型糖尿病患者的临床及生化指标结果分析
Tab1 Clinicalcharacteristicsofthetype2diabeticpatients
项目 Item非脑梗塞组Non-cerebral
infarctiongroup脑梗塞组Cerebral
infarctiongroupP值 Pvalue例数Cases7930-性别（男/女）Sex（male/female）39/4018/12-年龄（岁）Age（year）60.9±10.467.2±9.70.012病程（年）Duration（year）6.8±6.610.6±7.90.024体重指数Bodymassindex（kg/m2）23.59±3.4524.01±4.37＞0.05高血压患病率 Prevalenceofhypertension（%）50.6（n=40）66.7（n=20）＞0.05收缩压Systolicbloodpressure（mmHg）140.0±24.7145.5±31.5＞0.05舒张压Diastolicbloodpressure（mmHg）82.8±11.882.1±13.5＞0.05血清C肽SerumC-Peptide（μg/L）2.04±1.521.96±1.08＞0.05餐后2小时C肽 2-hourpostprandialC-Peptide（μg/L）4.76±3.144.67±2.82＞0.05HbA1c（%）9.0±1.89.1±1.5＞0.05FMN（mmol/L）2.07±0.402.14±0.57＞0.05T-Ch（mmol/L）4.99±1.175.32±0.99＞0.05TG（mmol/L）1.46±0.691.75±0.64＞0.05HDL（mmol/L）1.19±0.571.08±0.26＞0.05LDL（mmol/L）3.49±1.143.56±1.04＞0.05ApoA1（mmol/L）1.27±0.151.28±0.13＞0.05ApoB100（mmol/L）0.82±0.230.83±0.23＞0.05Lp（a）（mg/L）78±4299±73＞0.05二、各组ACE基因型和等位基因频率的比较
各组ACE基因型和等位基因频率均达Hardy-Weinberg平衡。正常组和2型糖尿病总组ACE基因型及等位基因频率无显著性差异。糖尿病脑梗塞组DD基因型及D等位基因频率显著高于正常组及糖尿病非脑梗塞组，分别达0.43及0.60，见表2。糖尿病腔隙性脑梗塞与非腔隙性脑梗塞患者的ACE基因型及等位基因频率无显著性差异，见表2。
表2 各组ACE基因型和等位基因频率的比较
Tab2 FrequenciesofACEgenotypeandalleleintype2diabeticpatientsandnormalcontrolsubjects
组别 Group例数 nACE基因型频率ACEgenotypes
n（频率）
n（frequency）ACE等位基因频率ACEalleles
n（频率）
n（frequency）DDDIIIDI（1）正常组 Normalcontrolgroup529（0.17）23（0.44）20（0.39）41（0.39）63（0.61）（2）糖尿病总组 Diabetestotalgroup10923（0.21）48（0.44）38（0.35）94（0.43）124（0.57）（3）非脑梗塞组Non-cerebral
infarctiongroup7910（0.13）38（0.48）31（0.39）58（0.37）100（0.63）（4）脑梗塞组 Cerebralinfarctiongroup3013（0.43）10（0.33）7（0.23）36（0.60）24（0.40）（5）腔隙性脑梗塞组 Lacunarinfarctiongroup73（0.43）2（0.29）2（0.29）8（0.57）6（0.42）（6）非腔隙性脑梗塞组 Non-lacunarinfarctiongroup2310（0.43）8（0.35）5（0.21）28（0.61）18（0.39）注：ACE基因型频率的比较 ComparisonofACEgenotypefrequencies:（4）与（1）比 group（4）vsgroup（1）,χ2=6.69,P＜0.05；（4）与（3）比 group（4）vsgroup（3）,χ2=12.35,P＜0.01；（2）与（1）比 group（2）vsgroup（1）,χ2=0.38,P＞0.05；（5）与（6）比 group（5）vsgroup（6）,χ2=0.17,P＞0.05
ACE等位基因频率的比较：（4）与（1）比 ComparisonofACEallelefrequencies:group（4）vsgroup（1）,χ2=4.80,P＜0.05；（4）与（3）比group（4）vsgroup（3）,χ2=9.62,P＜0.01；（2）与（1）比 group（2）vsgroup（1）,χ2=0.40,P＞0.05；（5）与（6）比 group（5）vsgroup（6）,χ2=0.06,P＞0.05 三、多元逐步回归分析
以脑梗塞为因变量，性别、年龄、糖尿病病程、BMI、高血压史、收缩压、舒张压、ACE基因型及等位基因频率、HbA1c、FMN、血脂、载脂蛋白、Lp（a）作自变量，进行Logistic多元逐步回归，并得出校正的比数比（OR）。我们观察到ACE基因、年龄及Lp（a）与糖尿病脑梗塞有关，见表3。
表3 与糖尿病脑梗塞有关的因素
Tab3 Farctorsassociatedwithcerebralinfarctionintype2diabetesmellitus
变量名 VariableβOR95%CIPACE基因型 ACEgenotypeDD型* DDgenotype*2.047.692.35～25.190.001II型 IIgenotype-1.290.280.13～0.600.001ACE等位基因型 ACEalleleD基因* Dallele*1.705.471.39～21.560.015I基因 Iallele-1.570.210.05～0.790.022年龄Age0.0781.091.03～1.160.004Lp（a）0.111.121.03～1.220.011注：*为2型糖尿病脑梗塞的危险因素 Independentriskfactorsforcerebralinfarctionintype2diabetesmellitus
本研究通过对109名2型糖尿病患者进行ACE基因的分析，观察到DD基因型及D等位基因的频率在合并脑梗塞的糖尿病患者中明显升高，这与国外报道〔5〕的普通人群中ACE基因I/D多态性与脑梗塞相关的结论相一致。
据报道〔5〕，ACE基因DD型和D等位基因与脑梗塞的关系在腔隙性脑梗塞的患者中表现得尤为突出，但此结论尚存争议〔6〕。本研究中的糖尿病脑梗塞患者以非腔隙性脑梗塞为主，仅7名为腔隙性脑梗塞。腔隙性脑梗塞和非腔隙性脑梗塞ACE基因型及等位基因频率并无显著性差异（见表2）。由于样本量小，此结论还有待于今后加大样本量以进一步分析明确。
多元逐步回归分析（见表3）进一步揭示ACE基因DD型和D 等位基因 的OR（95%CI）分别为7.69（2.35～25.19）及5.47（1.39～21.56），为糖尿病患者脑梗塞发病的独立危险因素，不依赖于性别、年龄、糖尿病病程、C-P水平、血压、血糖及血脂代谢，而ACE基因II型和I等位基因的OR（95%CI）分别为0.28（0.13～0.60）及0.21（0.05～0.79），为糖尿病患者脑梗塞发病的保护因子。
ACE是肾素-血管紧张素系统（RAS）的关键酶。有研究〔5，8〕提示ACE基因I/D多态性与循环ACE活性水平有显著的相关性。DD型者ACE水平最高，DI型者其次，II型者最低。ACE酶活性升高不仅可加速血管紧张素Ⅱ的产生及缓激肽的分解，使局部血管张力增加，而且能促进血管平滑肌细胞的增殖〔5〕。此外，RAS的成分，如血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其受体亦存在于脑组织，循环中的AngⅡ也可作用于其大脑的受体（AT1，AT2受体）以调节血压及大脑的生理活动〔9〕。本研究所观察到的ACE基因与糖尿病脑梗塞的相关性是否与ACE参与动脉粥样硬化、增加脑部血管张力及与循环RAS对脑部的RAS起作用有关，尚有待进一步探讨。
此外，多元逐步回归分析显示，年龄和Lp（a）为糖尿病脑梗塞发病的独立危险因素，而病程、血压、HbA1c、FMN、T-Ch、TG、ApoA1、ApoB100等经校正后未显示有统计学意义。脑梗塞，尤其是腔隙性脑梗塞与年龄有关〔10，11〕。本研究证实这在糖尿病患者中也同样存在。此外，据报道〔12〕Lp（a）为缺血性中风的高危因素，它可促进动脉粥样硬化及血栓形成〔13〕。结合本研究的结果，我们认为Lp（a）是糖尿病脑梗塞另一个独立的危险因素。本研究中的糖尿病患者大多在接受正规的降压、降糖及降脂治疗，其血压及代谢的指标与脑梗塞未显示相关性，这可能与药物干预有一定的关系。而Lp（a）的浓度在很大程度上受基因apo（a）位点的控制，它与年龄、性别、血压、胆固醇或甘油三酯无明显相关性〔12〕，也不受饮食及药物的影响〔14〕。因此，Lp（a）的浓度相对比较稳定。
本研究显示了ACE基因I/D多态性在2型糖尿病脑梗塞发病中的作用及地位，从而提示了遗传因素在糖尿病脑梗塞发病中的重要作用。在此同时也证实了Lp（a）为糖尿病脑梗塞的高危因子。对这些指标的检测有助于早期发现糖尿病脑梗塞的高危人群，以尽早进行有关干预治疗，如用ACEI制剂等。这对改善糖尿病患者的远期生活质量，减少社会及家庭的经济负担具有重大的意义。
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（收稿：1998-06-22 修回：1998-12-08）
