HTML]刘靖华 陈惠孙 胡德耀 刘良明
摘 要：目的 探讨人参皂甙（GS）对创伤失血性休克免疫功能的调节作用。方法：分体内实验和体外实验两个部分。体内实验：给大鼠GS预处理3d后进行创伤失血性休克模型的复制，1d后处死动物，分别测定淋巴细胞和巨噬细胞的功能；体外实验：创伤失血性休克后1d处死动物，分离、纯化淋巴细胞和腹腔巨噬细胞，观察GS对免疫功能的影响。结果：和正常对照组大鼠相比，创伤失血性休克1d大鼠脾淋巴细胞增殖、IL-2活性、IL-2R表达均降低；巨噬细胞MHC-Ⅱ抗原表达、TNF-α释放降低，巨噬细胞的吞噬能力减弱。GS体内应用（2.5mg/100g）对创伤失血性休克大鼠脾淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能有明显的改善作用，表现在脾淋巴细胞增殖能力增强，脾细胞IL-2产生、IL-2R表达增加，巨噬细胞MHC-Ⅱ抗原表达、TNF-α释放及巨噬细胞的吞噬能力明显提高；一定浓度范围内的GS（1～100μg/ml）在体外应用对创伤失血性休克大鼠1d脾淋巴细胞和巨噬细胞的功能也有不同程度的改善作用。结论：人参皂甙在体内和体外对创伤失血性休克大鼠免疫功能抑制均有一定的改善作用。
关键词：人参皂甙；创伤/失血性休克；免疫调节；大鼠
严重创伤后免疫功能紊乱是机体易于继发感染的重要原因，而感染的发生则是创伤病人中、晚期死亡的主要原因。因此如何纠正创伤后免疫功能紊乱，控制感染发生是战创伤研究的重点课题。
人参皂甙（Ginsenoside,GS）是人参的主要有效成分，具有较强的免疫调节作用。对创伤、手术后免疫功能异常均有不同程度的恢复作用，但对严重创伤失血性休克后免疫功能改变是否也有调节作用尚不清楚。本实验从体内和体外应用两个方面观察GS对创伤失血性休克免疫功能的调节作用。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar雄性大鼠，体重200～280g，由第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。
1.2 实验设计及分组
体内实验：将动物30只随机分为正常对照、创伤对照和GS处理3个组，每组10只。给药剂量和途经参照文献［1］：按2.5mg/100g体重皮下注射GS，每日1次，连续3d。正常对照和创伤对照组皮下注射相同量的生理盐水。末次给药后1h行创伤失血性休克及其复苏术。创伤失血性休克后1d处死动物并测定各指标。
体外实验：取正常及创伤失血性休克后1d的动物各6只，处死动物后分离脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞。调细胞浓度为1×106/ml，分别加入终浓度为1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml的GS，观察各指标的变化。每个动物的每种指标均测3次，最后取其平均值进行统计分析。
1.3 模型
乙醚麻醉大鼠后，分别经颈内动脉和颈外静脉插管。插管完毕并待动物清醒后，钳夹折断其右后肢（局部无明显出血），然后经颈内动脉放血，10min内使血压下降到（35±5）mmHg（1mmHg=0.133kPa）。维持60min后复苏，复苏液为失血及两倍于失血的林格氏液。
1.4 试剂
ConA和LPS（Escherichiacoli,0111:B4）购自Sigma公司，小鼠抗大鼠CD25抗体（进口分装）购自北京中山公司，OX6和OX17（分别为小鼠抗大鼠I-A和I-E抗原的单克隆抗体）购自Serotec公司，TNF-α检测试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室，人参皂甙（GS）由白求恩医科大学基础普化教研室提供。
1.5 脾细胞的分离［2］
无菌获取脾脏，用剪刀反复剪切至糊状，然后用不锈钢网筛（100目）滤过。离心1000r/min、10min后弃上清，用低渗休克法溶解红细胞［2］。最后用RPMI-1640培养液悬浮细胞。台盼蓝染色，细胞活力>95%。
1.6 腹腔巨噬细胞的分离
过量乙醚处死大鼠，腹腔内注入无菌预冷的PBS30～50ml，按摩腹部1min，吸出腹腔液，离心1000r/min、10min，用RPMI-1640培养液悬浮细胞，于37°C、5%CO2培养箱中培养2h，洗去未贴壁细胞，轻轻刮下贴壁的巨噬细胞（Macrophage,Mφ），调细胞浓度为1×106/ml备用。经瑞氏染色法鉴定Mφ细胞纯度>90%；台盼蓝染色，细胞存活率>95%。
1.7 脾淋巴细胞增殖能力测定
取无菌制备的大鼠脾淋巴细胞悬液，并调细胞浓度为1×106/ml。于96孔无菌培养板内每孔加入：细胞悬液0.1ml，含有或不含有ConA的RPMI-1640培养液0.1ml（ConA终浓度5μg/ml），一式三孔。于37°C、5%CO2培养箱中培养48h，加入3H-TdR20μl（0.25μCi/ml）/孔，继续培养16h。用多头细胞收获仪收集细胞，用液闪仪测其放射性（cpm）。
1.8 IL-2活性（细胞法）［3］和IL-2受体测定（ELISA法）测定［4］
24孔培养板上每孔加入：脾细胞悬液1ml，ConA50μl（终浓度10μg/ml），于37°C，5%CO2培养中培养24h，离心。收集的上清-70°C保存，为IL-2待测样本；细胞用于IL-2R测定。IL-2活性和IL-2R测定的详细步骤见参考文献［3，4］。
1.9 腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ抗原表达的测定［5］
取腹腔巨噬细胞悬液1ml，加入OX6、OX17（荧光标记）各10μl，4°C避光放置30min，其间混悬细胞1次。用PBS洗涤细胞2次，上流式细胞仪进行测定。
1.10 TNF-α的测定
按试剂盒说明书操作。
1.11 腹腔巨噬细胞吞噬能力测定［6］
大鼠腹腔注入10%鸡红细胞1ml,30min后处死大鼠。分离腹腔巨噬细胞。吸0.5ml滴于载玻片上，37°C孵育30min，用生理盐水洗掉未贴片的细胞，晾干。用1∶1丙酮-甲醇液固定，姬姆萨-瑞氏染色液染色，在高倍镜下或油镜下观察计数200个巨噬细胞，计算吞噬率。
吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/巨噬细胞数×100%
1.12 统计学处理
实验所得数据以±s表示，分别用t检验进行统计学处理。
2 实验结果
2.1 GS对创伤失血性休克大鼠脾淋巴细胞增殖、IL-2活性、IL-2R表达的影响
和正常对照组大鼠相比，创伤失血性休克1d大鼠脾淋巴细胞增殖、IL-2活性、IL-2R降低。GS体内应用（2.5mg/100g）对大鼠淋巴细胞免疫功能有明显的升高作用，见表1。
表1 GS对创伤失血性休克1d大鼠脾淋巴细胞
功能的影响（n=6）
Tab1 EffectofGSonsplenocytefunction24hoursafter
trauma-hemorrhagicshock（n=6）
5612.2±151.44
6.83±0.56
0.350±0.01
2.2 GS对创伤失血性休克大鼠脾淋巴细胞免疫功能的体外调节作用
一定浓度范围内的GS（1～100μg/ml）在体外对创伤失血性休克大鼠1d脾淋巴细胞增殖、IL-2产生、IL-2R表达均有不同程度的升高作用，见表2。
表2 GS对创伤失血性休克1d大鼠脾淋巴细胞免疫功能的
体外调节作用（n=6）
Tab2 EffectofGSonsplenocytefunction24hoursafter
trauma-hemorrhageinvitro（n=6）
5724.5±438.26
7.83±0.75
0.3402±0.03
2.3 GS对创伤失血性休克大鼠腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ抗原表达、TNF-α释放、巨噬细胞吞噬活性的影响
和正常对照组大鼠相比，创伤失血性休克后1d大鼠腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ表达降低，TNF-α分泌减少，巨噬细胞吞噬活性降低。GS体内应用后对上述各指标均有明显的升高作用，见表3。
表3 GS对创伤失血性休克1d大鼠腹腔巨噬
细胞功能的影响（n=10）
Tab3 EffectofGSonpMφfunction24hoursaftertrauma-
hemorrhagicshock24hoursinvivo（n=10）
32.4±1.66
70.0±1.45
68.4±3.52
296.21±23.42
2.4 GS对创伤失血性休克大鼠腹腔巨噬细胞MHC-Ⅱ抗原表达、TNF-α释放、吞噬功能的体外调节作用
不同浓度范围内的GS（1～100μg/ml）在体外对创伤失血性休克1d大鼠MHC-Ⅱ抗原表达、TNF-α释放、吞噬功能均有不同程度的改善作用，见表4。
表4 GS对创伤失血性休克1d大鼠腹腔巨噬细胞
功能的体外调节作用（n=6）
Tab4 EffectofGSonpMφfunction24hoursaftertrauma-
hemorrhagicshockinvitro（n=6）
33.4±1.76
71.32±1.22
68.77±1.58
281.17±25.58
3 讨论
近年来的研究表明，一些中药的有效成分如黄芪多糖、人参皂甙、三七皂甙等均可不同程度地恢复创伤和烧伤后免疫功能的低下。杨贵珍［7］发现人参皂甙（GS）对手术应激（截肢术、胸壁手术和剖腹术）所引起的细胞免疫功能抑制有明显的调节效应和恢复作用，可完全拮抗腹腔巨噬细胞的受抑状态。
本实验发现，体内应用GS不仅可减轻创伤失血性休克对脾淋巴细胞增殖、IL-2释放、IL-2R表达的抑制程度，对巨噬细胞MHCⅡ抗原表达、TNF-α释放也有升高作用，可拮抗创伤失血性休克对巨噬细胞吞噬能力的抑制作用。表明GS对创伤失血性休克免疫功能抑制也有一定的改善作用。
本实验还发现，一定浓度范围内的GS在体外也可不同程度提高大鼠脾淋巴细胞和巨噬细胞免疫功能。表明GS对创伤失血性休克后淋巴细胞和巨噬细胞有直接的调节作用。在本实验中GS对创伤失血性休克免疫功能抑制仅有部分改善作用，说明创伤失血性休克的病理过程是复杂的，引起免疫功能改变的机制是多方面的，一种单一的措施不可能完全逆转其全部病理过程。上述结果为深入研究GS对创伤失血性休克对免疫功能的调节作用提供了重要线索。
基金项目：全军“九五”指令性课题（96L014）
作者简介：刘靖华（1965-），女，陕西省富平县人，博士，主治医师，主要从事休克与免疫方面的研究，发表论文11篇，现在附属西南医院麻醉科工作。电话：（023）68754649-800
刘靖华（第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆400042）
陈惠孙（第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆400042）
胡德耀（第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆400042）
刘良明（第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第二研究室，重庆400042）
参考文献:
［1］杨贵贞，麻彤晖.人参皂甙抗小鼠手术应激时细胞免疫细胞调整效应［J］.中国中西医结合杂志，1988，8（5）：479-484.
［2］B.米舍尔S.施吉［美］编著.细胞免疫学方法选编［M］.北京：人民卫生出版社，1986.20-23.
［3］StephanRN,KupperTS,GehaAS,etal.Hemorrhagewithouttissuetraumaproducesimmunosuppressionandenhancessusceptibilitytosepsis［J］.ArchSurg,1987,122（1）:62-69.
［4］陈永硕主编.现代实用免疫细胞化学技术［M］.上海：上海科学技术出版社，1997.98-101.
［5］AyalaA,PerrinMM,ChaudryIH.DefectivemacrophageantigenpresentationfollowinghemorrhageisassociatedwiththelossofMHCclassⅡ（Ia）antigens［J］.Immunology,1990，70（1）：33-38.
［6］巴德年主编.《当代免疫学技术与应用》［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.152-154.
［7］杨贵珍.对中药免疫药理学研究的思考［J］.中国免疫学杂志，1996，12（1）：3-5.
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