;蒋天舒，周晔，陈燕，陈波，谷明莉，邓安梅，仲人前
［摘要］目的探讨发作性睡病与HLA-DQB1基因的相关性。方法对30例发作性睡病患者的临床资料进行分析。用序列特异性引物-聚合酶链反应分型技术测定HLA-DQB1等位基因并与44例健康人检测的数据进行比较。结果发作性睡病患者组DQB10602基因频率为40%，与正常对照组9.09%相比较明显增高；未检出DQB10401-0402基因，与正常对照组9.09%相比较，经统计学分析，差异有显著性。结论HLA-DQB10602基因为中国发作性睡病人群的易感基因；HLA-DQB10401-0402基因为中国发作性睡病人群的保护基因。
［关键词］发作性睡病;HLA基因;易感性
StudyontheassociationbetweenHLA-DQB10602genesandnarcolepsy
JIANGTian-shuZHOUYeCHENYanetal.LabortaryDiagnosticsChangzhengHospitalSecondMilitaryMedicalUniversityandClinicalImmunologyCenterofPLAShanghai200003China
［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheassociationbetweenHLA-DQB1genesandnarcolepsy.MethodsHLAtypingwereperformedin30patientswithnarcolepsybyHLA-DQB1resolutionPCR-SSPConclusionHLA-DQB10602weresusceptibleallesfornarcolepsywhileHLA-DQB10401-0402maybeprotective.
［Keywords］narcolepsy;HLAgenes;susceptible
发作性睡病是一种常见于青春期前起病，并持续终生的慢性神经系统疾病。临床以不可抗拒的白天睡眠过多为特征尚可合并猝倒、入睡幻觉和睡眠瘫痪［1］。近年来国外已有关于发作性睡病与HLA抗原基因相关性的研究道［23］。本病对患者身心健康及生活质量有很大影响。本病病因不明，其发生可能是环境因素与遗传因素相互作用的结果［4］。我们用聚合酶链反应-序列特异性引物方法对HLA-DQB1等位基因进行检测，对它们在特异性发作性睡病及正常人的分布进行比较，以了解它们与特异性发作性睡病遗传易感性的关系。
1材料与方法
1.1研究对象特异性发作性睡病组：中国汉族患者30例，其中男24例，女6例；年龄9～40岁，平均18岁。全部患者经具体询问及查体，脑电图、头颅CT和MRI检查无异常所见，确诊为发作性睡病。对照组：为与患者同地区的、与患者无血缘关系的、无特异性发作性睡病发病史的健康人群，共44例。
1.2实验材料
1.2.1主要试剂TaqDNA聚合酶、QiagmpDNABloodMiniKit、HLA-DQB1基因分型试剂盒。
1.2.2主要仪器PCR自动扩增仪、微量凝胶电泳系统、紫外分光分析系统。
1.3诊断标准参照睡眠障碍国际分类［5，6］并结合发作性睡病的临床特征：患者有白天过度嗜睡或忽然肌无力主述。天天有频繁小睡或忽然进入睡眠状态。情感诱发致忽然双侧肌张力消失。多导睡眠图记录：睡眠潜伏期10min；REM睡眠潜伏期20min；多次小睡时间MSLT中平均睡眠潜伏期5min；两次以上睡眠开始时REM发作。
1.4实验方法
1.4.1基因组DNA的制备应用DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞中的DNA。取2μl的DNA样品，用紫外分光光度法检测样品的A值及纯度，最后DNA调准为100μg/ml。
1.4.2实验方法应用PCR-SSP方法检测HLA-DQB1位点的基因型。基因频率采用直接计算法。按Woolf公式计算相对风险度来评估该病与等位基因的关联强度。χ2检验对RR进行显著性检验。PC0.05为差异有显著性。将含有DNA、TaqDNA聚合酶、PCR-Mix的混合液以每孔10μl的量加入HLA-DQB1基因分型板的32个含特异性引物的小孔；以每孔12μl的量加入HLA-DQB1基因分型板的32个含特异性引物的小孔。PCR扩增条件为96℃预变性130s，63℃退火和延伸60s，1个循环；96℃变性10s，63℃退火和延伸60s，9个循环；96℃变性10s，59℃退火50s，72℃延伸30s，20个循环。
1.4.3基因型的确定以2%的琼脂糖凝胶电泳，90V稳压15min。紫外灯下观察，根据PCR产物的有无及分子量大小对照HLA-DQB1基因分型格局表
确定基因型别。1.5统计学方法用直接计数法计算基因频率。两组间基因频率的比较采用χ2检验。P值均用Bonferron法进行校正P值Pc0.05有统计学意义。
2结果
发作性睡病患者组和正常对照组HLA-DQB1基因频率的分布：发作性睡病组DQB10602基因频率较正常对照组增高；在发作性睡病组中未检出DQB10401-0402基因频率较正常对照组明显降低，经统计学分析差异有显著性。见表2。
表2HLA-DQB1基因在发作性睡病与正常对照组中的分布
3讨论
HLAⅡ类分子在自身反应性T细胞的成熟中以及T细胞活化和免疫识别中起重要作用。HLA具有高度多态性，不同的HLA分子因结构上的差别，非凡是抗原结合部位上某些氨基酸残基的不同，在一定程度上决定了HLA分子对自身抗原的亲和力，从而直接影响它们递呈抗原肽并激活特异性T细胞的能力。HLAⅡ类抗原分子多态性的氨基酸序列主要存在于分子外侧功能区的3个超变区中，这种多态性决定了不同HLAⅡ类分子与抗原结合部位即裂隙的细微差别，并且影响与抗原肽的结合。在HLA分子、抗原肽及T细胞受体三分子复合物的相互作用中因为某些原因机体不能区分自我和非我导致自身免疫反应的发生。据此推测，可能是这一类将自身抗原递呈给抗原特异性T细胞的非凡HLA分子携带着发作性睡病的遗传易感性，且可影响病情进展。
本研究采用PCR-SSP方法对HLA-DQB1等位基因进行了检测，结果发现HLA-DQB10602在发作性睡病及正常对照组中的基因频率分别为40%和9.09%，经统计学分析，差异有显著性。此结果进一步证实了HLA-DQB10602为发作性睡病的易感基因，与国外相关道一致［7～10］。在发作性睡病组中未检出HLA-DQB10401-0402而该基因在正常对照组中的频率为13.64%，经统计学分析差异有显著性。这说明HLA-DQB10401-0402可能为该病的保护基因。不同的HLAⅡ类基因产物参与递呈不同的抗原肽，并诱发出特异性和强度不同的免疫应答。HLA-DQB10602可能在免疫应答过程中起重要的调控作用，使T细胞激活，导致免疫反应增强，参与发作性睡病病变的形成。HLA-DQB10401-0402在免疫反应的调控过程中可能起到负反馈作用，导致具有不同HLAⅡ类抗原等位基因的免疫应答能力和对发作性睡病易感性的差异。
HLA-DQB10401-0402可能为该病的保护基因，这在过去的研
究中从未提及，也许是我们HLA-DQB1高分辨的分型，使分型更为细致所发现，也可能因为过去研究例数较少所致。在中国人群中，发作性睡病患病率只有0.04%左右［11，12］。本研究亦显示，中国发作性睡病患者与DQB10602存在一定的相关性，但要对发作性睡病患者做进一步的诊断、治疗，尚需更深层次的探索。
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