骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞SDF

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【摘要】本研究探讨骨髓基质细胞衍生因子-1（SDF-1）在骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓间充质干细胞（MSC）中的表达水平。采集MDS的骨髓标本，分离、培养和扩增MSC，观察细胞形态并进行表型鉴定；以实时定量RT-PCR法检测间充质干细胞SDF-1基因和内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因的表达水平，并与健康供者的表达水平相比较。结果发现，MDS患者骨髓间充质干细胞SDF-1基因的表达水平经GAPDH校正后为1.53±0.92，与对照组（5.51±0.99）相比差异非常显著（P<0.01）。结论：SDF-1基因在MDS患者骨髓间充质干细胞中的表达显著升高，SDF-1基因的异常表达可能影响MDS患者骨髓微环境的造血调控作用，是否可对MDS的发病机制及治疗提供新的思路值得进一步探讨。

【关键词】骨髓增生异常综合征

　　ExpressionofSDF-1GeneinBoneMarrowMesenchymalStemCellsofPatientswithMyelodysplasticSyndrome

　　AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheexpressionlevelofstromalcellderivedfactor-1gene（SDF-1）inbonemarrowmesenchymalstemcells（MSC）ofpatientswithmyelodysplasticsyndrome（MDS）.TheMSCfrombonemarrowsamplesofMDSpatientswereisolated，culturedandexpanded，themorphologyandimmunophenotypeofMSCwereanalyzed.TheexpressionlevelsofSDF-1andinternalreferenceGAPDHinMSCofMDSpatientsweredetectedbyreal-timequantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction（RQ-RT-PCR）methodandwerecomparedwithexpressionlevelsofhealthydonors.TheresultsshowedthattheexpressionlevelsofSDF-1inMDSpatientsweresignificantlydifferentfromthoseinhealthydonors（1.53±0.92vs5.51±0.99）（P<0.01）.SDF-1geneexpressionlevelsinbonemarrowMSCofMDSpatientsweresignificantlyhigherthanthatinMSCderivedfromhealthydonors.ItisconcludedthattheabnormalexpressionofSDF-1geneinMSCmayinfluencetheregulationofhematopoiesisofthebonemarrowmicroenvironmentinMDSpatientsanditisworthyoffurtherinvestigationfornewclueonetiologicalmechanismandtreatmentofMDS.

　　Keywordsmyelodysplasticsyndrome;mesenchymalstemcell;SDF-1gene;real-timequantitativeRT-PCR

　　骨髓增生异常综合征（myelodysplasticsyndromes，MDS）是一组以血细胞的质和量异常为特征的血液系统异质性疾病，迄今为止发病机制尚不明确。多数研究者认为，MDS由造血干细胞的恶性克隆性增殖引起，关于骨髓造血微环境是否参与其发病目前还存在争论［1］。间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）是骨髓造血微环境的重要成分，我们在新近的研究中发现，来源于MDS患者的骨髓间充质干细胞，其体外支持造血的功能显著弱于健康者来源的MSC［2］，由此设想，骨髓造血微环境特别是间充质干细胞功能的异常可能涉及MDS的发病机制。基质细胞衍生长因子-1（SDF-1）属于CXC型趋化因子，在骨髓间充质细胞中高表达，与表达于CD34+造血干/祖细胞及白血病细胞上的受体CXCR4特异性结合，在骨髓微环境对造血的调控中发挥重要作用。近年来的研究还发现，SDF-1/CXCR4与急、慢性白血病等血液系统肿瘤中恶性造血细胞的生长与增殖密切相关［3］，但对其在MDS发病中的作用尚缺少研究。为此我们进行了初步研究，以实时定量RT-PCR法检测了SDF-1基因在MDS患者骨髓MSC中的表达，并与健康人MSC的表达水平相比较。

　　材料和方法

　　研究对象

　　8例未经治疗的MDS患者，依照2000年WHO诊断标准，7例为难治性贫血（RA），1例为难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB），其中男8例，女2例，中位年龄52（34-78）岁。髂骨穿刺获得骨髓穿刺物10ml，标本加肝素抗凝。同时采集8例健康供者的骨髓标本作为对照。

　　间充质干细胞的分离及培养

　　骨髓标本置于1.077g/ml的Ficoll分离液（Biochrom公司）上，400×g离心20分钟，收集单个核细胞，用PBS洗2次，以（2-4）×105／cm2的密度接种于75cm2培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中培养，培养体系为Dexter完全培养液（Invitrogen公司）。72小时后去除非贴壁细胞，每周换液2次。待细胞生长至瓶底90％融合时，以0.25%的胰蛋白酶消化，1∶3传代。

　　RNA提取

　　用TRIzoL试剂（Invitrogen公司）从间充质干细胞中提取总RNA。紫外分光光度仪测定260和280mm处的吸光值，计算RNA浓度和纯度。

　　cDNA逆转录合成

　　逆转录反应体系为20μl，包括标本RNA1μg，随机引物100ng和逆转录酶等，42℃条件下反应1小时，-20℃保存备用。

　　实时定量RT-PCR检测

　　SDF-1基因引物由PrimeExpressTM软件设计完成，上游引物：5′-GCCTGAGCTACAGATGCCCA-3′；下游引物：5′-TTCGGGTCAATGCACTTGT-3′。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因的表达作为内参照，其上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′;下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。在ABIPrism7700（美国AppleraCorporation，Norwalk公司）实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增。反应体系25μl，包括上、下游引物各0.3μmol/L，SybrGreenPCRMastermix（美国AppleraCorporation，Norwalk公司）12.5μl及10ngcDNA。

　　标准曲线的制作

　　为保证PCR扩增的有效性及分析的准确性，首先从人Stro-1＋MSC细胞系（法国Morad.Bensidhoum博士建系并提供）中提取总RNA，逆转录合成cDNA，连续稀释为0.1-50ng/5μl的浓度系列，进行SDF-1和GAPDH的实时扩增，制作标准曲线。以cDNA浓度为横坐标，CT值（cycleatthreshold，即PCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长期的拐点所对应的循环次数），计算曲线的相关系数r值，以>0.99认为结果可靠。

　　SDF-1基因表达的计算方法

　　以CT值代表PCR扩增的相对产量；ΔCT表示靶基因SDF-1基因与GAPDH基因的之间CT差值，即ΔCT（MDS患者SDF-1基因）＝CT（MSD患者SDF-1基因）-CT（GAPDH），ΔCT（正常供者SDF-1基因）＝CT（正常供者SDF-1基因）-CT（GAPDH）；ΔΔCT＝ΔCT（MDS患者SDF-1基因）-ΔCT（正常供者SDF-1基因）。

　　统计学处理

　　以ANOVA检验比较靶基因SDF-1在MDS患者和健康供者骨髓间充质干细胞中的表达，以P<0.01表示差异具有统计学意义。