肌萎缩侧索硬化症血浆、脑脊液谷氨酸变化的研究

肌萎缩侧索硬化症血浆、脑脊液谷氨酸变化的研究姚晓黎-BY2007-2-2616:39:00

中国神经精神疾病杂志，2003，29（4）：252-255

中山大学附属第一医院神经科姚晓黎张为西卢锡林张成

[摘要]目的初步探讨肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）患者血浆、脑脊液谷氨酸的改变,为治疗提供依据。方法应用毛细管电泳-激光诱导荧光检测器，测定ALS患者和对照组患者的血浆及脑脊液谷氨酸含量，并进行统计分析。结果ALS患者血浆、脑脊液谷氨酸的含量均明显升高，与对照组相比有显著性差异（p<0.05）。散发性与家族性ALS患者血浆、脑脊液谷氨酸的含量无显著性差异。不同病情患者间脑脊液谷氨酸含量也有区别，病情越重，脑脊液谷氨酸含量越高，其差别具有统计学意义。结论ALS患者血浆和脑脊液的谷氨酸水平较正常高，脑脊液谷氨酸浓度比血浆浓度敏感，谷氨酸水平升高程度与病情相关。

[关键词]肌萎缩侧索硬化症谷氨酸脑脊液

AstudyonchangesofplasmaandCSFglutamatelevelsinALSYaoxiaolizhangweixiluxilinzhangchengDepartmentofneurology,thefirstaffiliatedhospital,ZhongshanUniversity

[Abstract]ObjectiveTofigureouttherelationshipbetweenAmyotrophiclateralsclerosis（ALS）andglutamateandfindoutmoreeffectivetreatment.MethodsCE-LIFtechniquewasemployedtodetecttheglutamatelevelsinCSFandplasma.ResultsThedifferenceofglutamateconcentrationsinplasmaandCSFbetweenALSpatientsandcontrolgroupwassignificant（p<0.05）.ThedifferenceofglutamateconcentrationsinplasmaandCSFbetweenSALSpatientsandFALSpatientswasnotsignificant.Therewasstatisticdifferenceamongthemild,moderate,severepatientsandcontrolgroups.TheconcentrationsofglutamateinCSFincreasedwiththeaggravationofthedisease.ConclusionsOurresultsshowedthattheglutamateconcentrationsinplasmaandCSFofALSpatientswerehigherthancontrol.Theglutamateconcentrationswererelatedtotheseverityofthedisease.CSFglutamatewasmoresensitivetoreflectthestatusofthediseasethanplasmaglutamate.

[Keywords]AmyotrophiclateralsclerosisglutamateCSF

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一种选择性侵犯运动神经元的致命性、进行性神经系统变性疾病。本病以男性患者多见，一般在40~50岁起病，发病后3~5年死亡。主要表现为脊髓和脑干所支配的肌肉无力、萎缩、肌束震颤，球麻痹和锥体束征；感觉系统一般不受侵犯。其发病机制尚未完全清楚，尚无特效治疗。目前主要认为ALS发病与谷氨酸兴奋毒性有关。本研究应用毛细管电泳-激光诱导荧光检测器（capillaryelectrophoresiswithlaserinducedfluorescein，CE-LIF），测定ALS患者和对照组患者的血浆及脑脊液谷氨酸含量，旨在了解ALS患者与血浆、脑脊液谷氨酸的变化。

1材料与方法

1.1研究对象

1.1.1病例组：确诊ALS患者45例作为研究对象，其中女性11例，男性34例。年龄18-79岁，平均年龄为44.44±13.38岁。包括4个家系15例FALS患者。其中轻度患者19例，中度患者13例，重度患者13例。1.1.2对照组：同期非神经系统变性患者46例作为对照组。其中男性31例，女性15例，年龄17~76岁，平均41.24±12.50岁。两组间性别和年龄无显著差异。

1.2试剂与仪器

1.2.1毛细管电泳仪：购自美国Beckman公司。CE-LIF最常用的激发光源是氩离子激光器的488nm谱线。衍生化试剂：异硫氰酸荧光素异构体I（fluoresceinisothiocyanateisomerI，FITC）购自sigma公司。谷氨酸标准品购自sigma公司。1.2.2毛细管电泳的分离条件设定：（1）开口石英毛细管：总长度380mm，有效长度300mm，内径75m；（2）电压：28KV，温度：20℃；（3）进样模式：压力进样8s；（4）清洗毛细管：每次进样之前，毛细管均要经HCl（0.1M）,NaOH（0.1M）,三蒸水，四硼酸钠缓冲液（0.03MpH9.8）进行冲洗，冲洗时间各为2分钟。

1.3.1标本收集：所有患者（病例组和对照组）抽取空腹外周静脉血3mL，取血浆，保存于-80℃冰箱中备用。常规腰穿留取2mL脑脊液，保存于-80℃冰箱。1.3.2衍生化反应过程：取1.5mLEP管，加入100L谷氨酸标准溶液或待测标本，400LNaHCO3液（20mM，pH9.6），10LFITC-丙酮溶液（610-4M），混匀；室温、黑暗中反应16小时。1.3.3建立谷氨酸标准曲线：取谷氨酸标准溶液：210-8M、510-8M、110-7M、310-7M、510-7M、710-7M和110-6M，各100L，加入400LPH9.620mMNaHCO3，与10L6.410-4MFITC-丙酮溶液进行衍生化反应，衍生化反应时间为16h。在毛细管电泳仪上进行分离，测定相应的荧光强度。以谷氨酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。1.3.4血浆和脑脊液标本的检测：所有血浆标本稀释100倍，脑脊液标本稀释10倍。标本经去蛋白、衍生化反应后，应用CE-LIF测定谷氨酸浓度。

1.4统计学处理全部数据均采用SPSS（10.0）统计软件包进行统计分析。

2.1谷氨酸标准曲线：谷氨酸标准溶液与荧光强度的线性相关系数r=0.997，直线回归方程y=47.012x4.816。衍生化检测方法的性能指标：

2.1.1精密度：2.1.1.1对照组的血浆标本批内测定的结果：变异系数为3.62%（n=10）批间测定的结果：变异系数为4.17%（n=10）2.1.1.2对照组的脑脊液标本批内测定的结果：变异系数为7.34%（n=10）批间测定的结果：变异系数为4.88%（n=10）2.1.2最低检测限：当基线噪音相应于信噪比为2时，计算出谷氨酸的浓度即为最低检测限。其结果为210-8M。2.1.3回收率：2.1.3.1对照组的血浆标本平均回收率为97.16%~102.39%（n=5）2.1.3.2对照组的脑脊液标本平均回收率为92.27%~101.07%（n=5）

2.2ALS患者血浆谷氨酸含量检测

如表1所示，ALS病例组年龄构成与对照组之间无明显差异（p>0.05），ALS组血浆谷氨酸浓度明显升高，与对照组比较有显著性差异（p<0.001）。

表1ALS患者血浆谷氨酸含量检测结果组别例数年龄（岁）血浆谷氨酸浓度（M）ALS患者4544.44±13.3875.65±20.44*对照组4641.24±12.5057.96±3.40t值1.1815.788p值p=0.241p<0.001*与对照组比较的t检验，p<0.001

2.3ALS患者脑脊液谷氨酸含量检测

如表2所示，ALS病例组年龄构成与对照组之间无明显差异（p>0.05），ALS组脑脊液谷氨酸浓度明显升高与对照组比较有显著性差异（p<0.001）。

表2ALS患者脑脊液谷氨酸含量检测结果组别例数年龄（岁）脑脊液谷氨酸浓（M）ALS患者3143.45±13.868.11±2.71*对照组4641.24±12.503.81±0.86t值0.72910.073p值p=0.468p<0.001*与对照组比较的t检验，p<0.001

2.4SALS与FALS患者血浆谷氨酸含量检测

如表3所示，SALS组年龄构成与FALS组之间无明显差异（p>0.05），两组血浆谷氨酸浓度比较无显著性差异（p>0.05）。

表3SALS与FALS患者血浆谷氨酸含量检测结果组别例数年龄（岁）血浆谷氨酸浓度（M）SALS患者3044.17±14.8976.23±20.54FALS患者1545.00±10.1374.47±20.90t值0.1950.270p值p=0.846p=0.788

2.5SALS与FALS患者脑脊液谷氨酸含量检测

如表4所示，SALS组年龄构成与FALS组之间无明显差异（p>0.05），两组脑脊液谷氨酸浓度比较无显著性差异（p>0.05）。

表4SALS与FALS患者脑脊液谷氨酸含量检测结果组别例数年龄（岁）脑脊液谷氨酸浓度（M）SALS患者2643.54±14.677.86±2.65FALS患者543.00±9.779.43±2.92t值0.0781.199p值p=0.938p=0.240

2.6轻、中、重度ALS患者血浆谷氨酸含量检测

如表5所示，ALS患者年龄越大，病情越重，且重度组年龄明显高于对照组（p<0.05）。血浆谷氨酸含量随病情加重有升高趋势，中、重度组明显高于对照组和轻度组（p<0.001），但轻度患者与对照组比较则没有明显差别（p>0.05）。表5轻、中、重度ALS患者血浆谷氨酸含量检测结果组别例数年龄（岁）血浆谷氨酸浓度（M）对照组4641.24±12.5057.96±3.40轻度ALS1937.05±12.8854.77±5.73中度ALS1348.31±6.3284.89±9.88*，§重度ALS1351.38±14.58*96.91±10.59*，§F值4.649178.957p值p<0.05p<0.001*与对照组比较p<0.001；§与轻度组比较，p<0.0012.7轻、中、重度ALS患者脑脊液谷氨酸含量检测结果

如表6所示，年龄越大的ALS患者，病情有加重趋势，且重度组年龄明显高于对照组（p<0.05）。脑脊液谷氨酸含量随病情加重有升高趋势，轻、中、重度组均明显高于对照组（p<0.001），中度组明显高于轻度组，重度组明显高于轻、中度组（p<0.001）。

表6轻、中、重度ALS患者脑脊液谷氨酸含量检测结果组别例数年龄（岁）脑脊液谷氨酸浓度（M）对照组4641.24±12.503.81±0.86轻度ALS1133.18±11.025.42±1.31*中度ALS847.13±6.518.21±0.95*，§重度ALS1250.42±14.79*10.52±2.07*，§，#F值4.312115.533p值p=0.007p<0.001*与对照组比较p<0.001；§与轻度组比较，p<0.001；#与中度组比较，p<0.001

体外培养发现谷氨酸浓度大于10uM时，对神经元有毒性作用。例如，在无Mg++的培养液中，小脑粒细胞因暴露于10uM谷氨酸溶液，50%细胞发生死亡。脑脊液谷氨酸浓度大于10uM，可能影响脊髓细胞外液。此脑脊液谷氨酸浓度是否毒害完整的中枢神经系统，是否与ALS患者的细胞损害有关，尚不能确定[1]。然而Perry（1990）[2]，Camu（1993）[3]研究认为ALS患者脑脊液谷氨酸浓度没有升高。本研究发现ALS患者脑脊液谷氨酸浓度明显高于对照组。这与Debelleroche（1984）[4]，Rothstein（1991）[5]，Shaw（1995）[6]，和Niebroj（1999）[7]等的报道相符。本实验也提示ALS患者谷氨酸的浓度与病情相关，病情越重，脑脊液谷氨酸浓度越高。这和Niebroj与Debelleroche等的发现重度ALS患者脑脊液谷氨酸浓度明显高于轻、中度患者的结果一致。至于血浆谷氨酸的水平，Patten（1978）[8]，Perry（1990），Shaw（1995）研究认为ALS患者血浆谷氨酸的水平并无升高。Camu等则认为血浆谷氨酸水平与首次发病部位有关，肢体首发型血浆谷氨酸水平升高，而延髓首发型血浆谷氨酸水平降低[7]。由于本组延髓首发型患者较少，只有3例，故不能进行统计分析。本组结果显示ALS患者血浆谷氨酸的水平较非运动神经元疾病患者高。但是轻度ALS患者血浆谷氨酸水平与对照组相接近。而中、重度患者，血浆谷氨酸水平明显升高。这与Plaitaki（1988，1993）[9，10]，GnageshBabu（1998）[11]，Niebroj（1999）对等研究结果相符。可能是由于细胞外液的谷氨酸浓度升高，导致兴奋毒性和神经元变性。谷氨酸从突触间隙扩散出来，被转运到血液中去，结果引起血中谷氨酸水平增高。这也可解释本组轻度患者脑脊液谷氨酸浓度升高，而血浆谷氨酸浓度暂时不升高。

出现不同结果的可能原因如下：（1）检测谷氨酸所用的仪器不同。象Patten和Perry使用自动氨基酸分析仪进行检测。该仪器的灵敏度、精密度及检测效能远不如高效液相仪，更不用说CE-LIF。毛细管电泳仪的灵敏度和分辨率均比高效液相仪高，且有高效的液体冷却系统，试剂消耗少，降低费用和成本；所需的样本量极少，可使有限的样品得以被充分利用。柱上检测，与平板凝胶电泳相比可进行快速、准确的定量。激光诱导荧光检测器与标准的紫外检测器相比，灵敏度可提高1000倍。氩离子激光器的488nm谱线与FITC最大激发波长490nm相近。FITC具有相当大的定量效率，能自发地与谷氨酸反应，产生稳定的衍生化产物。（2）血浆、脑脊液去蛋白所用的方法和试剂不同。Camu使用磺酸去蛋白，本组研究与Niebroj组一样，采用酸化甲醇去蛋白，这是目前被认为最好的方法。（3）病例的选择不同。一者与所采用诊断标准有关。本组患者的选择严格按照诊断标准，全部为确诊和拟诊的患者。应注意排除误诊。再者与患者病情的轻重有关，若入选的患者均为病情较轻的，则可能检测不到谷氨酸水平的升高，正如本实验中的轻度患者，血浆谷氨酸浓度并无明显升高。

由于存在血脑屏障的缘故，脑脊液谷氨酸浓度远低于血浆。血浆谷氨酸所受的影响因素较多，如饮食、运动及睡眠等均可改变血浆谷氨酸的水平。因此，本组对ALS患者和对照组均抽取清晨空腹静脉血，以消除外界影响因素。本研究发现ALS患者脑脊液谷氨酸浓度升高，而血浆谷氨酸水平在中、重度患者明显升高，轻度患者则无明显升高。提示脑脊液谷氨酸检测的重要性和特异性要高于血浆谷氨酸。这也与影响血浆谷氨酸代谢的因素较多，难以反映其水平有关。而脑脊液谷氨酸浓度相对稳定，波动性较少。我们认为，轻度ALS患者病理改变尚不明显，即使脑脊液谷氨酸浓度已有改变，但血浆谷氨酸浓度仍正常。说明血浆谷氨酸并不能反应病程早期病患部位谷氨酸的变化。随着病情的发展加重，脑脊液的谷氨酸含量不断升高，血浆谷氨酸水平也就出现明显升高。

本研究结果也从侧面支持了ALS发病机制的谷氨酸兴奋毒性学说，血浆及脑脊液中谷氨酸浓度的升高，与兴奋毒性持续作用有关。因此，早期诊断，早期治疗对阻断病情的发展，延长患者的生命，有重大意义。脑脊液和血浆谷氨酸浓度检测对于确诊早期患者和监测病情变化的意义，还有待进一部探讨。

FALS与SALS相比较，其血浆谷氨酸浓度无显著性差异，但两者谷氨酸含量均比对照组的谷氨酸含量高。说明谷氨酸兴奋毒性作用也参与了FALS的发病机制。在表达SOD1基因突变的FALS鼠模型中，Canton等[12]研究发现FALS鼠脊髓高亲和力的、钠依赖的谷氨酸摄取系统显著减少。这将导致谷氨酸水平升高，触发兴奋毒性作用。因此，抗谷氨酸治疗也适用于FALS。

1.FavaronM,ManevH,AlhoH,etal.Gangliosidespreventglutamateandkainateneurotoxicityinprimaryneuronalculturesofneonatalratcerebellumandcortex.ProcNatlAcadSciUSA,1988;85（19）:7351-52.PerryTL,KriegerC,HansenS,etal.Amyotrophiclateralsclerosis:aminoacidlevelsinplasmaandcerebrospinalfluid.AnnNeurol,1990;28:12-73.CamuW,BilliardM,Blady-MoulinerM.FastingplasmaandCSFaminoacidlevelinamyotrophiclateralsclerosis:asubtypeanalysis.ActaNeurolScand,1993;88:51-54.DebellerocheJ,RecorgatiA,RoseCF.ElevatedlevelsofaminoacidsintheCSFofmotorneurondiseasepatients.NeurochemPathol,1984;2:1-65.RothsteinJD,KunclR,ChaundhryV,etal.Excitatoryaminoacidsinamyotrophiclateralsclerosis:anupdate.AnnNeurol,1991;30:224-56.ShawPJ,ForrestV,IncePG,etal.CSFandplasmaaminoacidlevelinmotorneurondisease:elevationofCSFglutamateinasubsetofpatients.Neurodegeneration,1995;4:209-2167.NiebrojDI,JanikP.Aminoacidsactingastransmittersinamyotrophiclateralsclerosis.ActaNeurolScand,1999;100:6-118.PattenBM,HaratiY,AcostaL,etal.Freeaminoacidlevelsinamyotrophiclateralsclerosis.AnnNeurol,1978;3:305-99.PlaitakisA,ConstantatakisE,SmithJ.Theneuroexcitotoxicaminoacidsglutamateandaspartatearealteredinspinalcordandbraininamyotrophiclateralsclerosis.AnnNeurol,1988;24:446-910.PlaitakisA,ConstantatakisE.Alteredmetabolismofexcitatoryaminoacids,N-acetyl-aspartateandN-acetyl-aspartyl-glutamateinamyotrophiclateralsclerosis.BrainResBull,1993;30:381-611.GnageshBabu,BawariM,MathurVN,etal.Bloodglutamatelevelsinpatientswithmotorneurondisease.ClinChimActa,1998;273:195-20012.CantonT,PrattJ,StutzmannJM,etal.GlutamateuptakeisdecreasedtardivelyinthespinalcordofFALSmice.Neuroreport,1998;9（5）:775-8