TTT治疗脉络膜黑色素瘤实验研究首席医学网2009年03月17日10:41:24Tuesday中华临床医师杂志征稿内科临床新进展研讨班重症与血流动力学大会血液净化技术学习班医学类核心期刊征稿第六届世界中医药大会2009世界高血压大会第四届中国国际白血病急危重病护理交流会IOF亚洲骨质疏松班2009年中国药学大会医学影像学术交流会结直肠肛门外科会议口腔正畸学术会议征稿广东研究生学术论坛
作者：王宏彬，王光璐，王名扬，彭晓燕作者单位：1（100050）中国北京市，首都医科大学附属北京友谊医院眼科；2（100037）中国北京市，首都医科大学附属北京同仁眼科中心
加入收藏夹【摘要】 目的：探讨人脉络膜黑色素瘤经瞳孔温热疗法（transpupillarythermotherapy,TTT）治疗后的组织病理学变化和细胞凋亡相关研究。方法：对经临床TTT治疗不能控制的巨大脉络膜黑色素瘤患者摘除眼球，石蜡包埋切片，行组织病理学检查，VIII因子免疫组织化学研究，并应用TUNEL方法对TTT治疗区域行细胞凋亡检测。结果：TTT治疗后，在激光斑照射的肿瘤部位，最外层为湿性坏死区，其细胞结构消失。中间为干性坏死区，细胞核固缩，在干性坏死区及其下方的肿瘤组织中，可见大量凋亡染色阳性细胞及巨噬细胞，在激光斑基底部可见肿瘤毛细血管呈扩张状态。结论：TTT治疗脉络膜黑色素瘤可以直接摧毁肿瘤组织导致坏死，同时也会引起肿瘤细胞凋亡。但如果瘤体组织太厚，不能完全破坏，则肿瘤下方组织激光后会引起局部毛细血管扩张，是否会加重转移，尚需进一步探讨。
【关键词】经瞳孔温热疗法；细胞凋亡；脉络膜黑色素瘤
ExperimentalstudyofTTTtreatmentofchoroidalmelanoma
HongBinWang,GuangLuWang,MingYangWang,XiaoYanPeng
1DepartmentofOphthalmology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China;
2DepartmentofOphthalmology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100037,China
AbstractAIM:Todiscusstherelatedresearchofhistopathologicchangesandapoptosisaftertranspupillarythermotherapytreatmentonhumanchoroidalmelanoma.METHODS:TTTfortheclinicaltreatmentbeyondthecontrolofchoroidalmelanomapatientswithhugeeyeballsremoved,paraffinembeddedsections,thehistopathologicalexamination,VIIIfactor,immunohistochemicalstudyanddetectapoptosisonTTTtreatmentregionbyTUNELmethod.RESULTS:AfterTTTtreatment,thelaserspotirradiatedtumorsite'scellstructuredisappears,andtheoutermostlayeriswetnecroticarea.Themiddlelayerisdrynecrosis,nuclearpyknosis,inthedrynecrosisareasandbelowthetumortissue.Positivestainingcanbeseenalargenumberofapoptoticcellsandmacrophages,tumorcapillarywasvisibleinexpansioninthelaserspot.CONCLUSION:TTTtreatmentofchoroidalmelanomacandirectlyleadtothedestructionoftumortissuenecrosis,butalsocausedtumorcellapoptosis.However,ifthetumorthickcannotbecompletelydestroyed,thetumorbeneathwillcauselocalizedtelangiectasiaafterthelaser.Whetheritwillincreasethetransferneedtobefurtherexplored. KEYWORDS:transpupillarythermotherapy；apoptosis;melanoma
经瞳孔温热疗法（transpupillarythermotherapy,TTT）目前广泛应用于治疗眼部脉络膜黑色素瘤，视网膜血管瘤，转移癌等，但其治疗机制仍在进一步研究。我们通过对TTT治疗失败的人脉络膜黑色素瘤手术摘除眼进行分子生物学检测，研究激光治疗对人脉络膜黑色素瘤的组织病理学影响和细胞凋亡在其中的作用，以进一步了解TTT的治疗机制。
1材料和方法
1.1材料
选用3例TTT治疗失败的人脉络膜黑色素瘤患眼。所有患者均在同仁眼科中心门诊应用科林公司提供的810nm半导体红外激光（Iridex,oculight,SLx,用特殊的TTT转接器安装在裂隙灯上）行TTT治疗。激光的光斑直径3mm,能量800mW，时间1min×2次。治疗后1wk因肿瘤不能控制，在患者知情同意的情况下，门诊摘除患眼，送同仁医院眼科病理取材并制作蜡块（图1B），进行组织病理学，免疫组织化学和细胞凋亡检测。
1.2方法
切片制作：选激光斑处行5μm厚度连续石蜡切片，置于APES胶片上。60℃烤片8h以上备用。用伊红和苏木素染色进行组织病理学检查。细胞凋亡TUNEL（terminaldeoxynucleotidyltransfeasemediateddUTPbiotinnickendlabeling）试剂盒检测：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗；2.5g/L高锰酸钾及草酸脱色素。微波炉热修复2min；胰酶消化20s，PBS洗5min×3次；冰上加TritonS100，PBS洗；加tunnel试剂，37℃孵育1h，PBS洗；加入AP试剂，37℃孵育0.5h，PBS洗，BCIP/NBT显色。脱水，透明，封片。对照组选用未行激光的脉络膜黑色素瘤组织。免疫组化研究：选取有激光斑的瘤组织切片，应用VIII因子一抗（SantaCruz公司）及通用型二抗，两步法孵育后，DAB染色。
正常未经治疗的脉络膜黑色素瘤组织未见细胞凋亡的发生，肿瘤细胞排列紧密。激光治疗后的脉络膜黑色素瘤组织阴性对照：加tunnel制剂时，只加DUTP，未加酶，未见凋亡阳性表达。TTT治疗后，在人眼激光斑照射的肿瘤部位，最外层可见大片湿性坏死区，其内组织细胞结构消失。中间为干性坏死区，可见肿瘤细胞核固缩（图1A），在干性坏死区及其下方的肿瘤组织中，可见大量凋亡染色阳性细胞及巨噬细胞侵入（图1C）。激光斑基底部干性坏死区肿瘤组织中可见局部毛细血管广泛扩张，VIII因子免疫组织化学染色阳性（图1D）。
经瞳孔温热疗法目前主要应用于治疗老年黄斑变性，脉络膜黑色素瘤[15]，TTT亦可作为放射敷贴治疗的辅助治疗。其优点是可以轻易到达眼后节，加快缩小肿瘤组织，减少对周围正常组织的破坏。作为恶性肿瘤的治疗方法，其治疗后组织坏死的深度及治疗机制，尚需要进一步研究。我们的研究通过对TTT治疗后的人脉络膜黑色素瘤病眼进行检查，发现在激光斑照射的肿瘤部位，最外层可见大片湿性坏死区，其内组织细胞结构消失，这表明温热疗法本身可由于热效应导致局部黑色素肿瘤的直接坏死。中间为干性坏死区，干性和湿性坏死区域可以达到1.5mm深度。在干性坏死区及其下方的肿瘤组织中，可见大量凋亡染色阳性细胞及巨噬细胞侵入。这表明TTT治疗中瘤细胞凋亡和细胞坏死共同存在，同时伴随巨噬细胞的吞噬作用。与传统激光不同，TTT传送的热能可使眼底温度升高至45～60℃，这一温度不至于象激光光凝那样，引起细胞的即刻坏死，而是首先导致细胞膜的损害，蛋白质变性，染色质破坏以及细胞生化功能的紊乱等，数小时及数天后，才发展为坏死。故我们认为对于小的肿瘤组织，只要TTT光斑可以覆盖，会收到较好的效果。但TTT治疗后1wk，我们发现激光斑基底部肿瘤组织可见局部毛细血管明显扩张，我们认为可能是由于热效应刺激毛细血管反应性扩张。国外文章报道[6]，TTT治疗失败眼，7例中有5例发生巩膜外转移，在这5例中，B超仅发现1例。我们发现的TTT治疗后肿瘤基底部毛细血管扩张有可能是加速巩膜外转移的原因之一，应该引起重视。所以，对于TTT治疗后的肿瘤眼尤其是瘤体较大的需二次治疗的肿瘤眼要密切观察随访。对于早期巩膜外转移，由于B超不宜发现，会对患者造成危险，所以病例的选择应该非常慎重。我们认为对于恶性肿瘤，最好选择一次激光治疗就可以覆盖并摧毁瘤体的眼进行治疗，这样会增加安全性。这一治疗技术与肿瘤转移的关系尚需要进行多中心大样本的研究。 总之，我们发现TTT治疗脉络膜黑色素瘤可以直接摧毁肿瘤组织，引起肿瘤细胞的坏死，及肿瘤基底部瘤细胞的凋亡，同时促进吞噬细胞侵入。但TTT激光治疗后可以引起光斑下方肿瘤组织毛细血管扩张，有可能会加重巩膜外转移，这一点应该引起重视。
【参考文献】 1StoffelnsBM.Tumorregressionandvisualoutcomeaftertranspupillarythermotherapy（TTT）formalignantchoroidalmelanoma.KlinMonatsblAugenheilkd2006;223（1）:7480 2SpireM,DevouassouxMS,KodjikianL,etal.Primarytranspupillarythermotherapyfor18smallposteriorpoleuvealmelanomas.AmJOphthalmol2006;141（5）:840849 3DesjardinsL,LumbrosoLeRouicL,LevyGabrielC,etal.Combinedprotonbeamradiotherapyandtranspupillarythermotherapyforlargeuvealmelanomas:arandomizedstudyof151patients.OphthalmicRes2006;38（5）:255260 4KiratliH,BilgicS,SylemezogluF,etal.Peripheralsubretinalpigmentaccumulationfollowingtranspupillarythermotherapyforchoroidalmelanoma.OphthalmicSurgLasersImaging2008;39（1）:6062 5AabergTMJr,BergstromCS,HicknerZJ,etal.Longtermresultsofprimarytranspupillarythermaltherapyforthetreatmentofchoroidalmalignantmelanoma.BrJOphthalmol2008；92（6）:741746 6ZaldivarRA,AabergTM,SternbergPJr,etal.Clinicopathologicfindingsinchoroidalmelanomasafterfailedtranspupillarythermotherapy.AmJOpththalmol2003;135（5）:657663
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