刘斌司徒镇强吴军正陈建元
摘要目的:研究六亚甲基二乙酰胺（HMBA）诱导人粘液表皮样癌（MEC-1）细胞分化与细胞P53蛋白表达和细胞增殖周期的关系。方法:MTT比色法测定HMBA对MEC-1细胞体外生长的作用;Feulgen染色测定细胞DNA含量;ABC免疫酶染色检测P53蛋白;FCM法测定细胞增殖周期。结果:HMBA对MEC-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性;HMBA诱导的细胞与对照细胞比较,DNA含量减少,P53蛋白水平降低,G1期细胞数增加和S期细胞数减少。结论:HMBA对MEC-1细胞的诱导分化作用与其调节P53基因蛋白表达和细胞增殖周期有关。关键词粘液表皮样癌六亚甲基二乙酰胺P53蛋白细胞增殖周期
EffectsofHexamethyleneBisacetamideonP53ProteinExpressionofMEC-1CellLineandCellDifferentiation
LiuBin,SituZhenqiang,WuJunzheng,etalCollegeofStomatology,theFourthMilitaryMedicalUniversity
AbstractObjective:ToinvestigatetherelationshipbetweenthedifferentiationofthemucoepidermoidcarcinomacelllineMEC-1inducedbyHMBAandtheexpressionofP53protein.Methods:EffectsofHMBAonthegrowthofMEC-1cellsinvitroweremeasuredwithMTTcolorimetricassay,andthecontentofDNAincellswasassayedbyusingFeulgen'sstaining.TheP53proteinexpressionofMEC-1cellswasdetectedwithABCimmunohistochemistrywithanti-mutantP53proteinantibody,andthedistributionofcellsindifferentdifferentiationphasewasdeterminedbyflowcytometry.Results:HMBAinhibitedthegrowthofMEC-1cellsinadose-dependantandtime-dependantmanner,andHMBA-treatedMEC-1cellswerearrestedintheG1phaseandhadalowercontentofDNAandalowerlevelofP53proteincomparedwiththecontrolgroup.Conclusion:ThedifferentiationofMEC-1cellsinducedbyHMBAmaybeassociatedwiththeregulationofHMBAontheP53proteinexpressionandthecelldifferentiationcycle.Keywords:mucoepidermoidcarcinomaHMBAP53proteincelldifferentiationcycle
作者以往对低分化型粘液表皮样癌（mucoepidermoidcarcinoma,MEC）来源的MEC-1细胞系的分化诱导研究表明,分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺（hexamethylenebisacetamide,HMBA）对体外培养的以及裸鼠体内移植的MEC-1细胞均有显著的生长抑制作用和分化诱导作用［1,2］。目前,对HMBA的分化诱导作用机理尚不十分清楚。本实验旨在探讨MEC-1细胞的分化与P53抑癌基因蛋白表达和细胞周期的相互关系。
1材料和方法1.1分化诱导剂配制及细胞培养 HMBA（Sigma,美国）配制成0.5mol/L母液,用培养液稀释至所需浓度。人粘液表皮样癌MEC-1细胞系（第四军医大学口腔生物学教研室建立）用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液（GIBCO,美国）,在37℃、5%CO2及100%湿度条件下培养。用MTT比色法［3］测定HMBA以不同浓度、不同时间和不同方式对MEC-1细胞体外生长的细胞存活分数的影响。1.2Feulgen染色 MEC-1细胞培养在含1mmol/L的HMBA培养液或对照培养液中,4天后,取细胞铺片,按常规Feulgen染色法显示细胞核DNA,用图像分析仪定量分析其相对含量,每个样本分析100个细胞,用t检验进行统计处理。1.3ABC免疫酶染色 细胞处理及标本制备同1.2节。用鼠抗人突变型P53抑癌基因蛋白抗体（北京中山生物技术公司）及ABC试剂盒（Vector公司,美国）,按常规ABC法染色,标本分析同1.2节。1.4流式细胞术（FCM） 实验分3组,加药组MEC-1细胞用1mmol/L或4mmol/L的HMBA体外诱导培养48小时;去药组细胞用1mmol/L或4mmol/L的HMBA体外诱导培养96小时,更换无药培养液培养48小时;对照组用无药培养液培养。分别用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（1∶1）消化细胞,制备单个细胞悬液,70%冷乙醇固定,PBS洗涤,再用1%TritonX-100、0.01%RNase和0.05%PI处理,通过300目尼龙网备检。用ProfileⅡ型流式细胞仪,在488nm激发波长下测定细胞DNA,用Multicycle软件分析细胞周期分布情况。
2结果2.1HMBA对MEC-1细胞生长的影响 用MTT比色法测定的结果见图1。HMBA在1mmol/L对MEC-1细胞作用2天后开始产生抑制作用,并随着浓度增加和作用时间延长生长抑制作用更明显。在HMBA作用4天后再去药培养,MEC-1细胞逐渐恢复增殖。表明HMBA对MEC-1细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性,并具有一定的可逆性。
图1HMBA对MEC-1细胞生长的影响HMBA组○1mol/L,△2mol/L,□4mol/L去除HMBA组●1mol/L,▲2mol/L,■4mol/L
2.2HMBA对MEC-1细胞DNA含量及P53蛋白表达的影响 Feulgen染色标本用图像分析仪分析结果显示,MEC-1细胞在1mmol/L的HMBA诱导4天后,细胞核平均DNA含量显著下降（表1）。
表1HMBA对MEC-1细胞DNA及P53蛋白水平的影响
分组DNA（）P53（）P53阳性率（%）对照组183.42±6.73183.70±8.6016.31HMBA组175.54±3.91175.72±6.009.71
P53抗体染色标本用图像分析仪分析结果显示,MEC-1细胞在1mmol/L的HMBA诱导4天后,细胞抑癌基因P53蛋白水平显著下降（表1）。2.3HMBA对MEC-1细胞系细胞增殖周期的影响 HMBA诱导48小时后,处于S期的MEC-1细胞比例下降、G1期比例升高,并呈剂量依赖性。HMBA诱导96小时后去药培养48小时,MEC-1细胞各时相比例有所恢复（表2）。
表2HMBA对MEC-1细胞细胞增殖周期的影响（%）
分组细胞周期各时相比例G1期S期G2期对照组63.220.116.7HMBA组1mmol/L67.117.613.0 4mmol/L83.54.012.5去除HMBA组1mmol/L65.721.713.0 4mmol/L65.711.722.6
